核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一种死体营养型植物病原真菌,寄主范围广泛,可侵染大豆、花生、油菜等油料作物及药用植物、蔬菜、花卉在内的600余种植物,所引起的菌核病分布广、危害重,造成极大经济损失。核盘菌属于多型菌态(Polymorphism)的植物病原真菌,在其生活史及侵染循环过程中形成菌核,侵染垫,子囊盘和子囊孢子等多种形态。其中,菌核是核盘菌无性生殖和有性生殖相互转换的重要结构,在其生长发育及致病过程中发挥重要作用。菌核形成受到复杂信号途径的精细调控Rapamycin采购,因此,进一步探究菌核的形成与调控机制,有助于解析核盘菌生长发育与致病的关键环节,为有效防控菌核病提供理论依据。细胞自噬(Autophagy)是真核生物对细胞内物质进行降解和周转的生物过程。研究表明,细胞自噬在植物病原真菌生长发育和侵染致病等方面起重要作用,但其生物学功能尚未在核盘菌中得到解析。因此,本研究利用遗传学、分子生物学以及生物化学等多种手段探究了细胞自噬蛋白激酶SsAtg1及其互作蛋白对核盘菌自噬发生、菌核发育、侵染垫形成及致病力的调控机制,解析了核盘菌TOR(Target of rapamycin)信号途径和PP2C磷酸酶(Type 2C protein phosphatases)SsPtc3与细胞自噬的关联,研究结果如下:1.自噬相关基因SsATG1调控自噬发生,影响核盘菌菌核形成和致病力。自噬途径由自噬相关基因(Au Topha Gy-related genes,ATGs)分级调控,Atg1复合物是参与自噬起始的最上游组分。在菌丝与菌核的比较转录组中,发现SsATG1在菌核阶段表达量显著上升。利用Split-marker方法对SsATG1基因靶向敲除后,在MDC(Dansylcadaverine)染色和蛋白质免疫印迹中发现ΔSsatg1的细胞自噬途径被阻断。SsATG1参与核盘菌营养和氧化胁迫的响应,并且ΔSsatg1无法形成菌核,菌核发育相关基因SsPAC1,SsSCD1和SsTHR1的表达量均显著低于野生型。致病力分析表明,ΔSsatg1侵染垫的发育水平和穿透能力降低致使其在不同寄主上的致病力明显减弱。综上所述,SsATG1是核盘菌调控细胞自噬途径的核心基因,在核盘菌胁迫响应、菌核形成、侵染垫发育和致病力等方面均发挥重要作用,研究结果为深入解析核盘菌中细胞自噬的生物学功能及调控机制提供理论基础。2.SsPtc3与SsAtg1互作,介导核盘菌胁迫响应与致病力。SsAtg1是自噬相关蛋白中唯一的蛋白激酶,在胁迫响应中具有重要作用。为揭示SsAtg1响应胁迫影响核盘菌生长发育及致病的作用机制,以SsAtg1为诱饵蛋白,利用酵母双杂交筛选核盘菌c DNA文库,获得与SsAtg1互作候选蛋白10个,包括SsPtc3、SsAtg13和SsPho85等。SsPtc3属于PP2C磷酸酶,是响应外界胁迫调控细胞功能的重要蛋白,通过酵母双杂交和pull down实验表明SsAtg1与SsPtc3存在相互作用。SsPTC3缺失后,自噬水平降低,ΔSsptc3的菌丝生长缓慢,胁迫响应和菌核发育异常,致病力显著降低。进一步分析发现ΔSsptc3的侵染垫发育正常,但菌丝在植物细胞内的扩展变慢。综上,PP2C磷酸酶SsPtc3与SsAtg1互作,并参与核盘菌胁迫响应和影响菌核形成及致病力。3.SsAtg1互作蛋白SsAtg13不影响核盘菌致病。Atg13是Atg1复合体的重要组成部分,调控Atg1激酶活性,在酵母中与饥饿条件下维持细胞活性有重要作用。酵母双杂交实验表明SsAtg1与SsAtg13存在相互作用,为解析Atg1复合体调控核盘菌生长发育和致病的作用,对SsATG13进行基因敲除。SsATG13缺失后自噬水平较野生型降低,ΔSsatg13在营养缺陷培养基中菌丝生长速率较野生型缓慢。但与ΔSsatg1不同,ΔSsatg13可以形成菌核且侵染垫形成和致病力与野生型无显著差异。研究表明,SsAtg13与SsAtg1互作,但在核盘菌菌核发育和致病过程中不发selleck合成挥主要作用,进一步证明Atg13功能的多样性且SsAtg1是介导核盘菌菌核形成和致病力的重要蛋白。4.SsTOR调控核盘菌细胞自噬与细胞壁完整性。雷帕霉素靶标TOR(Target of rapamycin)是一类高度保守的Ser/Thr蛋白激酶,是细胞自噬的调控因子。在核盘菌基因组中仅存在一个与酿酒酵母TOR激酶Tor1(47.25%)和Tor2(48.7%)相似的同源蛋白,将其命名为SsTOR。为了探究核盘菌SsAtg1响应营养胁迫的机制与TOR途径的关联,利用RNAi对SsTOR进行基因沉默。SsTOR沉默后,自噬水平显著增加。SsTOR沉默菌株表现为菌丝生长速率显著降低,菌核和侵染垫发育异常且致病力明显下降。磷酸化分析表明,SsTOR参与核盘菌细胞壁完整性通路影响SsSmk3的磷酸化水平。综上,SsTOR是一种调控核盘菌细胞生长、胁迫响应、细胞壁完整性、自噬和致病力的全局调控因子。综上所述,本研究明确了自噬相关基因SsATG1影响核盘菌细胞自噬,并对核盘菌胁迫响应、菌丝生长、菌核发育及致病力起到重要调控作用。解析了SsAtg1与SsPtc3互作参与核盘菌胁迫响应,影响核盘菌致病的相关机制。明确了SsTOR在核盘菌生长发育中的全局调控作用,并探optical biopsy究了SsTOR影响自噬的分子机制。研究结果为自噬蛋白激酶SsAtg1与其他信号途径的相互交联提供了新思路,加深了细胞自噬对于核盘菌菌核发育及致病机制的理解,为菌核病的有效防控提供重要的分子基础。