木薯(Manihot esculenta Crantz)作为世界第六大粮食作物,广泛种植于我国华南地区。随着农业生产的技术创新和木薯产量的提高,木薯的相关产业在我国农业Spatiotemporal biomechanics经济中占据重要地位。但木薯病毒病始终是农业生产中危害最为严重的病害,木薯普通花叶病毒(Ca-ssava common mosaic virus,Cs CMV,genus Potexvirus,famiselleck HPLCly Alphaflexiviridae)作为我国新近报道的一种潜在威胁木薯产业的病毒,在东南亚等国家发病率逐年递增,已呈现出全球蔓延的趋势。植物病毒侵染性克隆作为研究病毒复制、运动等机制的重要工具,有助于了解植物-病毒-载体相互作用的复杂过程。本研究以前期在我国首次报道发现的Cs CMV海南儋州Hainan-DZ分离物(Cs CMV-HN)为基础,采用一步法构建其全长c DNA侵染性克隆,并将其改造成能够系统性表达外源报告基因GFP的植物病毒表达载体,为后续开展Cs CMV病毒基因功能及其致病机制的研究奠定了基础,主要研究结果如下:(1)成功构建农杆菌介导的侵染性克隆p Cs CMV-HN本研究采用In-Fusion无缝克隆方法,将Cs CMV-HN的全长基因组序列克隆到p Green II-35S载体上,成功构建了其全长c DNA侵染性克隆p Cs CMV-HN。通过农杆菌注射接种本生烟和木薯扦插苗,3次重复试验结果显示,在接种第10-14天,本生烟和木薯扦插苗系统叶均出现褪绿等病症;在接种第45天,本生烟和木薯扦插苗的新生嫩叶均有明显的褪绿,叶皱等症状。经RT-PCR检测和病症观察统计,侵染性克隆p Cs CMV-HN在本生烟和木薯扦插苗中的侵染效率达100%。(2)采用重复的CP亚基因组启动子(SGP)表达外源基因策略,成功构建了2种可通过系统性侵染本寻找更多生烟和木薯植株过表达GFP的Cs CMV表达载体本研究成功构建了分别包括90 bp和171 bp重复Cs CMV的CP亚基因启动子(SGP)序列的植物病毒表达载体p Cs CMV-GFP和p Cs CMV-GFP-m1,通过农杆菌注射接种本生烟和木薯植株,经荧光观测,RT-PCR和Western blot检测分析,结果显示:p Cs CMV-GFP和p Cs CMVGFP-m1均可以介导GFP在本生烟和木薯植株中系统过表达GFP,且p Cs CMV-GFP-m1检测到的GFP荧光信号更强,GFP表达更高。(3)利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)2A多肽与Cs CMV的CP融合串联表达外源基因策略,成功构建了可通过系统性侵染本生烟植株过表达GFP的Cs CMV表达载体为进一步提高Cs CMV表达载体的稳定性,本研究采用FMDV编码2A多肽与Cs CMV CP融合串联表达外源基因的策略,成功构建了表达GFP的Cs CMV表达载体p Cs CMV-GFP-2A。接种本生烟第7-10天,在紫外灯照射下可以观察到非接种叶有强烈的绿色荧光,第25天绿色荧光强度达到最强。进一步经RT-PCR和Western blot分析验证了p Cs CMV-GFP-2A可通过感染本生烟系统性过表达GFP,但p Cs CMV-GFP-2A接种木薯植株并未检测到GFP表达。