第一章 应激致认知功能障碍中星形胶质细胞吞噬受体MERTK/MEGF10的变化规律目的:观察慢性束缚应激对大鼠认知功能的影响,检测前额叶皮质、海马、杏仁核、纹状体神经元的病理改变和星形胶质细胞活化、吞噬受体表达情况。方法:(1)采用慢性束缚应激(CRS)方法建立慢性应激小鼠模型,16只SD大鼠随机分为对照组和慢性束缚应激组;(2)采用ELISA法检测脑脊液、血浆GC含量;(3)采用旷场实验检测大鼠自主行为、探究行为与紧张度,采用Morris水迷宫实验检测大鼠的空间学习记忆能力,采用物体识别实验通过检测大鼠对已熟悉物体与新陌生物体的探索时间长短的评价动物Cell Imagers的一般学习记忆能力;(4)采用q PCR、WB、免疫荧光法检测前额叶皮质、海马、杏仁核、纹状体突触结构蛋白、MEGF10、MERTK表达情况,配合稀疏标记病毒脑立体定位注射,观察树突棘密度变化;(5)ELISA法检测前额叶皮质、海马、杏仁核、纹状体Aβ沉积情况。结果:(1)CRS大鼠血浆、脑脊液皮质酮水平显著升高、体重下降;(2)CRS导致大鼠发生认知障碍,表现为空间学习记忆能力受损、一般学习记忆能力受损、自主探究能力下降、情绪处于焦虑状态;(3)CRS大鼠海马的树突棘密度下降,前额叶皮质、海马突触结构蛋白PSD95、GAP43、SYP表达下降,Aβ沉积增加;(4)前额叶皮质、海马星形胶质细胞发生A1型活化,MERTK水平升高,MEGF10水平不变。结论:(1)慢性束缚应激导致大鼠出现认知障碍,前额叶皮质、海马神经元树突棘减少、突触结构损伤、Aβ沉积;(2)慢性束缚应激大鼠星形胶质细胞活化、MERTK水平升高,可能与上述变化有关;(3)杏仁核、纹状体神经元、星形胶质细胞无上述改变,可能与认知障碍发生无关。第二章 MERTK在应激致认知功能损伤中作用目的:通过下调MERTK表达翻转认知功能障碍和神经元病理改变,验证慢性应激时认知功能障碍及神经元病理改变是否与星形胶质细胞激活、MERTK表达升高有关。方法:(1)通过r AAV-sh Mertk海马立体定位注射,建立Ctrl+GFP、Ctrl+sh Mertk、CMLN4924研究购买RS+GFP、CRS+sh Mertk四组模型。(2)采用ELISA法检测大鼠脑脊液、血浆GC含量;(3)采用旷场、Morris水迷宫、物体识别实验评价动物学习记忆能力;(4)采用q PCR、WB、免疫荧光法检测海马神经元树突棘密度、突触结构蛋白变化,及星形胶质细胞活化和吞噬受体MERTK表达情况。(5)采用荧光共聚焦扫描三维重建海马星形胶质细胞吞噬突触结构蛋白情况。结果:相比于应激组,干扰序列为GGAAGAAATCAAGCCAGATCA的r AAV-sh Mertk海马脑立体定位注射能有效降低海马星形胶质细胞Mertk表达,减少海马星形胶质细胞吞噬突触结构情况,翻转CRS引起的认知功能障碍及神经元病理变化;结论:慢性束缚应激导致大鼠出现认知障碍,海马神经元树突棘减少、突触结构损伤、Aβ沉积,与星形胶质细胞活化、MERTK水平升高、吞噬功能增强密切相关。第三章 应激致星形胶质细胞吞噬异常的分子机制目的:建立应激细胞模型,探究GC升高Mertk的可能机制,研究MERTK在星形胶质细胞吞噬功能中的作用方法:(1)在体外采用不同浓度、不同时间GC干预小鼠小脑星形胶质细胞系C8-D1A,建立合适的应激细胞模型;(2)通过查询UCSC基因数据库、NCBI和JASPAR基因数据库,寻找GC与Mertk启动子可能的结合部位;(3)染色质免疫共沉淀法验证预测的GRE(GC结合原件)结合效率和富集倍数(4)抑制MERTK功能,观察C8-D1A体外吞噬Aβ情况的变化。结果:(1)100μM 4h GC干预寻找更多星形胶质细胞,Mertk升高水平最高,Megf10表达水平不变;(2)RU486干预应激细胞模型,Mertk水平下降;(3)实验组和阴性对照组的富集倍率和富集效率之比小于8,GRE不在Mertk上游2000bp启动子区域内;(4)UNC2250干预星形胶质细胞后,在体外吞噬Aβ能力减弱。结论:(1)GC通过糖皮质激素受体(GR)及其基因组效应升高Mertk;(2)糖皮质激素结合元件(GRE)位于Mertk基因上游启动子2kb区域之外,或者GC通过某种方式间接上调Mertk表达;(3)星形胶质细胞通过MERTK的活性形式p-MERTK发挥吞噬作用,能在体外有效吞噬Aβ蛋白。