季节性流感病毒(Seasonal influenza virus)每年感染全球5%～15%的人口,导致约50万人死亡。近年来出现的高致病性禽流感病毒,如H5N1和H7N9,同样给人类造成致命威胁。此外,流感病毒与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)共感染也会大大增加重症比例与死亡风险。因此,流感的防治依然是不可小觑的公共卫生与健康问题。迄今为止,已有三类抗流感病毒药物批准上市,分别是M2离子通道阻滞剂、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)抑制剂和核酸内切酶抑制剂。但随着各类药物的广泛应用,越来越严重的耐药性问题逐渐暴露出来。因此,研发新型、高效、抗耐药性或具有新骨架的抗流感病毒药物具有重要意义。神经氨酸酶和核酸内切酶分别在流感病毒的传播和mRNA转录过程中发挥重要作用。它们在A型和B型流感病毒中高度保守,是药物设计的理想靶标。本论文针对上市药物神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和核酸内切酶抑制剂巴洛沙韦存在的耐药性问题,一方面通过靶向神经氨酸酶的活性位点和150-cavity,采用多位点结合策略对奥司他韦C-5位氨基进行修饰,设计并合成了五个系列新型奥司他韦衍生物;另一方面通过靶向核酸内切酶,采用“优势骨架再定位”策略,设计并合成了一个系列具有新骨架的核酸内切酶抑制剂。一、新型含苄氧基苄基类奥司他韦衍生物的设计、合成与活性评价基于对奥司他韦羧酸(Oseltamivir carboxylic acid,OSC)与NA复合晶体结构的分析,发现 OSC 的 C-5 位氨基朝向由 Glu119、Leu134、Ile117、Va1116、Phe115、Ala138、Glu136、Arg156和Asp151等氨基酸残基构成的150-cavity。本章以OSC为先导化合物,根据150-cavity中氨基酸残基的分布特征及课题组前期对150-cavity探索所获的构效关系,综合运用多位点结合、生物电子等排等策略,保留靶向入口区域的苄基优势片段,通过在苄基对位引入结构多样性的取代基,充分探索150-cavity中间区域和底部区域的优势基团,设计并合成了系列I共39个新型含苄氧基苄基类奥司他韦衍生物。体外抑酶活性结果显示,除化合物I-21c、I-27c和I-28c外,其余化合物均为group-1 NAs选择性抑制剂,它们对野生型(H1N1和H5N1)和突变型(H5N1-H274Y)NAs表现出中等到优异的抑制活性。其中,I-5c对H1N1、H5N1和H5N1-H274Y NAs的抑制活性最为突出,其IC50值分别为0.3、0.09和0.3 μM,略弱于或优于OSC(H1N1,IC50=0.01 μM;H5N1,IC50=0.03 μM;H5N1-H274Y,IC50=1.6 μMCL 318952细胞培养)。体外抗病毒活性结果显示,I-5c 对 H1N1(EC50=0.07 μM)和 H5N1(EC50=1.0 μM)的抑制活性与 OSC(H1N1,EC50=0.06μM;H5N1,EC50=0.8 μM)相当,且无细胞毒性(CEFs,CC50>200μM;MDCK,CC50>250μM)。分子对接表明,I-5c具有与OSC相似的作用模式,新引入的4-(3-甲氧基苄氧基)苄基伸向150-cavity,其末端甲氧基与保守氨基酸残基Asp151形成新的氢键。此外,理化性质预测结果表明,Ⅰ-5c具有良好的类药性。总之,鉴于Ⅰ-5c的高效抗耐药性特征,可作为先导化合物供进一步优化。二、新型含硼酸类奥司他韦衍生物的设计、合成与活性评价化合物Ⅰ-5c与NA的作用模式表明,形成额外氢键作用可显著提升化合物的抗耐药性。本章第一节以Ⅰ-5c为先导化合物,采用生物电子等排策略将其末端甲氧基替换为含丰富氢键供受体的取代基,设计并合成了系列ⅡA共18个新型奥司他韦衍生物。基于系列ⅡA的活性结果,发现含4-(3-硼酸苄氧基)苄基取代的化合物ⅡA-2c的活性最佳,其末端硼酸可与N1-H274Y的150-cavity中Glnl36和Val149形成多重氢键。因此,为进一步提高其活性,本章第二节以ⅡA-2c为先导化合物,保留其末端硼酸取代的苯环,采用多样化导向的结构修饰和分子杂合策略分别对其连接linker和连接苯环进行系统的构效关系研究,设计并合成了系列ⅡB共35个新型含硼酸类奥司他韦衍生物。体外抑酶活性结果显示,系列ⅡA对野生型(H1N1、H5N1和H5N8)NAs具有中等到较弱的抑制活性。部分化合物(ⅡA-2c、ⅡA-3c、ⅡA-12c、ⅡA-14c和ⅡA-17c)对H5N1-H274Y NA表现出与OSC相当或更高的抑制活性,尤其是ⅡA-2c的抑制活性比OSC提高近4倍。在系列ⅡB中,对连接linker修饰的化合物抑酶活性急剧下降,而对连接苯环修饰的化合物表现出中等到强效的抑制活性。其中,ⅡB-26c～ⅡB-35c(IC50=0.007～32.6 μM)对野生型(H1N1、H5N1 和 H5N8)和突变型(H5N1-H274Y 和 H1N1-H274Y)NAs表现出相当于或优于OSC(IC50=0.06～55.2 μM)的抑制活性。值得一提的是,化合物ⅡB-27c对两种突变型NAs的抑制活性分别是OSC的78.9和3.5倍,ⅡB-33c 分别是 OSC 的 74.6 和1.6 倍。同时,ⅡB-27c(EC50=0.008～1.3 μM)和 ⅡB-33c(EC50=0.008～5.4 μM)对H5N1、H5N8和H1N1的抗病毒活性强于或相当于OSC(EC50=0.06～8.6 μM)。此外,ⅡB-27c和ⅡB-33c在H5N1和H5N8病毒感染的鸡胚模型中表现出与OSC相当或略高的鸡胚保护作用。初步成药性评价显示,ⅡB-27c和ⅡB-33c在人血浆和人肝微粒体中具有与OSC相当的稳定性;在大鼠体内药代动力学评价中,它们表现出中等的药代动力学性质。综上,本研究拓展了适配于NAs 150-cavity的结构类型,通过结构优化得到体外和体内活性优异的先导化合物ⅡB-27c和ⅡB-33c,值得进一步研究。三、新型含环烷烃类奥司他韦衍生物的设计、合成与活性评价本章在上一章研究的基础上,以课题组前期发现的联苯类奥司他韦衍生物JMC20I为先导化合物,为进一步提高其活性并改善其理化性质,进行了系统的结构修饰及构效关系探讨。首先,采用多位点结合、生物电子等排等策略,将JMC20I末端苯环替换为环烷烃或含环烷烃的稠环,通过提高化合物的Fsp3值来改善其理化性质,设计并合成了系列ⅢA共25个新型奥司他韦衍生物。基于系列ⅢA的NA抑制活性,以ⅢA-4c为先导化合物,保留其环戊烯优势片段,采用分子杂合策略,对连接苯环进行精细的结构修饰,通过占据150-cavity更多的化学空间来提高其活性,设计并合成了系列ⅢB共14个新型奥司他韦衍生物。在系列ⅢA化合物中,ⅢA-4c的抑酶活性最佳,对H1N1、H5N1、H5N8和H5N1-H275YNAs(IC50=0.4～4.1 μM)的抑制活性与 JMC20I(IC50=0.3～4.9 μM)相当。在系列ⅢB中,活性最好的化合物ⅢB-2c(IC50=0.03～0.3 μM)对野生型H1N1、H5N1和H5N8NAs的抑制活性相当于或优于OSC(IC50=0.05～0.07 μM)和JMC20I(IC50=0.3～0.7 μM)。尤其是,ⅢB-2c对突变型H5N1-H274Y和H1N1-H274YNAs的抑制活性分别是OSC的62.7和5.0倍,是JMC20I的7.7和4.4倍。在体外抗病毒实验中,ⅢB-2c(EC50=0.2～2.3 μM)对 H1N1、H5N1 和 H5N8 表现出与 OSC(EC50=0.06～12.3μM)相当或更高的抗病毒活性,且没有细胞毒性(CEFs,CC50>200 μM;MDCK,CC50>250μM)。此外,在H5N1和H5N8病毒感染的鸡胚模型中,ⅢB-2c具有优于OSC的鸡胚保护作用。分子对接阐明了 ⅢB-2c与NAs的结合模式并合理解释了构效关系。初步的成药性预测表明,ⅢB-2c具有比OSC更优的理化性质和ADMET性质。综上所述,ⅢB-2c是具有研究前景的先导化合物。四、新型吡啶并嘧啶酮类核酸内切酶抑制剂的设计、合成与活性评价唯一上市的核酸内切酶抑制剂巴洛沙韦已报道了耐药突变株(PAI38T/M),其他结构类型的核酸内切酶抑制剂存在骨架种类少、透膜性差等问题。本章根据现有核酸内切酶抑制剂的药效团特征,基于核酸内切酶与HIV-1整合酶、HIV-1 RNase H和HCVNS5B聚合酶活性位点的序列同源性,采用“优势骨架再定位”策略,将课题组前期在HIV-1整合酶/RNase H双靶标抑制剂中证明的吡啶并嘧啶酮优势骨架作为核酸内切酶金属离子螯合骨架,同时采用分子杂合策略,引入巴洛沙韦衍生物中优势的疏水性片段,设计并合成了 19个吡啶并嘧啶酮类核酸内切酶抑制剂。细胞实验结果显示,所有目标化合物在CEFs中均无细胞毒性(CC50>200 μM)。体外抗病毒活性结果表明,在50 μM浓度下,化合物Ⅳ-5k、Ⅳ-5p和Ⅳ-5q对H5N1和H5N8病毒表现出与OSC和利巴韦林相当的抑制率,但弱于BXA。进一步测试它们的EC50 值发现,化合物 Ⅳ-5k(H5N1,EC50=17.genetic variability2 μM;H5N8,EC50=31.6μM)对这两种病毒具有中等的抗病毒活性,与利巴韦林相当或弱于利巴韦林(H5N1,EC50=11.0 μM;H5N8,EC50=5.1μM)。令人意外的是,Ⅳ-5k(IC50=3.6 μM)在体外抑制PAN的活性优于BXA(IC50=10.5 μM)。分子对接显示,Ⅳ-5k与BXA具有相似的结合模式,分子中吡啶并嘧啶酮骨架螯合二价金属离子,4,4′-二甲氧基二苯胺延伸到两个疏水口袋,与设计理念相符。总之,Ⅳ-5k为具有新骨架的核酸内切酶抑制剂的进一步研发提Elexacaftor纯度供了结构基础。总体而言,本论文基于流感病毒对目前上市的抗流感病毒药物产生的日益严重的耐药性问题,针对神经氨酸酶和核酸内切酶开展了两方面的研究工作。在基于靶标结构的药物设计理念指导下,一方面综合运用多位点结合和生物电子等排策略,设计并合成了五个系列靶向活性位点和150-cavity的新型奥司他韦衍生物。经酶水平、细胞水平、鸡胚体内活性测试,以及人血浆和肝微粒体稳定性、大鼠药代动力学实验等,发现了3个分别含2-甲基-4-(3-硼酸苄氧基)苄基、2-氯-4-(3-硼酸苄氧基)苄基和3-氟-4-环戊烯苄基取代的奥司他韦衍生物,具有优异的抗耐药性和良好的理化性质。另一方面,通过“优势骨架再定位”和分子杂合策略,发现了一个系列具有全新结构的吡啶并嘧啶酮类核酸内切酶抑制剂,为后续抗流感药物研发奠定了基础。