研究背景与目的脑肿瘤流行病学统计发现,原发性脑肿瘤约占所有癌症的2%,其发病随着年龄的增长而增加,其中32%为恶性脑肿瘤,68%为非恶性脑肿瘤。脑胶质瘤是最常见的原发性恶性肿瘤,产生于大脑及脊髓胶质细胞的癌变。因脑胶质瘤具有高发病率、高复发率、高死亡率以及低治愈率等特点成为当下肿瘤领域研究的热点。目前脑胶质瘤的治疗过程中应用的一线药物主要为替莫唑胺,还有其他治疗方案如PCV化疗方案(甲基苄肼(Procarbazine,PCZ),长春新碱(vincristine,VCR),洛莫司汀(lomustine,CCNU))。针对脑胶质瘤的治疗药物缺乏,患者愈后差、生存期短等问题,寻找新的药物具有很重要的治疗意义。研究发现吲哚类化合物在对抗肿瘤中是通过影响多种靶点来发挥作用的,包括影响蛋白质、核酸、血管生成、侵袭转移、同时可以调控多种信号转导通路等,具有重要的研究意义及广阔的应用前景,在抗癌药开发中也一直深受关注,且已有研究发现吲哚类药物也可透过血脑屏障作用于脑瘤。因此本文选择了实验室中吲哚类系列活性化合物进行筛选,发现化合物3r具有较好的抗脑胶质瘤作用,并深入研究化合物3r在体内外对脑胶质瘤增殖、侵袭、迁移、血管生成的影响,探讨了化合物3r对脑胶质瘤的潜在治疗作用及作用机制。实验方法和结果1.采用MTT方法,顺铂(Cisplatin,DDP)作为阳性对照药,筛选抗脑胶质瘤活性化合物及脑胶质瘤敏感细胞株。结果发现化合物3r活性最强,对U87和U251细胞的抑制作用优于C6细Community infection胞。2.采用MTT方法,顺铂作为阳MRTX1133性对照药,检测了化合物3r对多种人正常细胞(HUVECs、bEnd.3、NHA)的细胞毒性,结果发现化合物3r具有较低的细胞毒性。3.在倒置荧光显微镜下观察化合物3r对U87和U251细胞形态的影响。结果发现,化合物3r可改变细胞的形态,使细胞由扁平变圆,且碎片化增多。4.采用克隆形成实验检测化合物3r对U87和U251细胞增殖及克隆形成能力的影响,结果发现化合物3r浓度依赖性地抑制克隆形成能力。5.采用Transwell实验、划痕实验检测化合物3r对U87和U251细胞侵袭、细胞迁移能力的影响,Western blot方法研究了相关蛋白表达水平的变化。结果发现化合物3r浓度依赖性地降低细胞内N-cadherin、MMP9和MMP2蛋白表达,增加E-cadherin蛋白表达,显著抑制细胞EMT过程,从而抑制侵袭迁移能力。6.采用血管生成拟态(vasculogenicmimicry,VM)实验,检测化合物3r对U87和U251细胞拟态血管生成能力的影响。实验表明,化合物3r对U87和U251细胞的拟态血管生成具有明显抑制作用。7.通过计算机模拟技术、分子模拟软件Schrodinger将化合物3r与多种相关蛋白进行分子模拟对接,发现化合物3r与微管蛋白以及GSK3β结合。8.采用Western blot方法检测化合物3r抑制U87和U251细胞侵袭、迁移能力的分子机制。结果发现,化合物3r通过调控GSK3β/β-catenin信号通路,使GSK3β蛋白表达水平降低,β-catenin表达下降,进而减少β-catenin入核影响EMT过程抑制细胞侵袭迁移。9.通过免疫荧光实验检测化合物3r对U87和U251细胞微管组织的影响。化合物3r对细胞周期及周期相关蛋白的变化采用PI染色法,流式细胞仪和Western blot方法检测。结果显示,化合物3r能够浓度依赖性地抑制U87和U251细胞的微管形成,可以将细胞阻滞在G2/M期,其作用与降低G2/M期蛋白Cyclin B1、CDK1的表达水平有关。10.通过Hoechst 33342染色法定性,AnnexinV-FITC/PI双染法定量检测化合物3r对脑胶质瘤细胞U87和U251细胞凋亡的影响,Western blot方法检测了细胞凋亡蛋白表达水平的变化。Hoechst 33342染色法、AnnexinV-FITC/PI双染法检测表明,化合物3r可以促进U87和U251细胞的凋亡,增加Bax表达水平,使Bcl-2表达水平下调。11.采用吖啶橙(acridineorange,AO)染色法,检测化合物3r对脑胶质瘤细胞U87和U251细胞自噬的影响。结果发现,化合物3r对U87和U251细胞自噬的影响不明显。12.采用Chemdraw及ADMET软件预测化合物3r透过BBB的动力学性质。通过体外细胞摄取实验,质谱成像代谢Bemcentinib小鼠组学检测化合物3r透过血脑屏障(BBB)的能力。结果发现,化合物3r具有透过BBB的动力学性质,在体外可以被脑微血管内皮细胞及脑胶质瘤细胞所摄取,同时化合物3r可透过血脑屏障分布在脑内,积累于脑肿瘤部位。13.建立裸鼠U87细胞原位脑胶质瘤的模型,通过小动物活体成像系统检测化合物3r对裸鼠U87细胞原位脑胶质瘤生长的影响。实验结果证实,随着化合物3r浓度的增加,对脑内肿瘤的抑制作用越来越显著。实验结论化合物3r对高侵袭性脑胶质瘤细胞的生长和侵袭迁移具有较好地抑制作用,可抑制脑胶质瘤U87和U251细胞增殖、侵袭、迁移及血管生成等。作用机制研究发现,化合物3r可抑制微管组织的形成、影响其结构促进细胞G2/M期阻滞并且诱导细胞凋亡。另外化合物3r对脑胶质瘤高侵袭性特点的抑制作用与β-catenin上游GSK3β的结合有关,该作用是通过影响β-catenin的表达,降低β-catenin的入核进而抑制EMT过程发挥。两方面的作用机制介导了其抑制脑胶质瘤增殖和迁移作用。但是化合物3r与GSK3β分子结构中的结合位点及更深入的机制还需进一步探讨。研究意义本论文在筛选了系列吲哚类化合物的抗脑胶质瘤活性基础上,研究了活性化合物3r对脑胶质瘤的治疗作用。通过一系列体外实验及体内实验验证其抗高侵袭性脑胶质瘤的作用,并寻找化合物新的作用靶点GSK3β,进一步对化合物3r治疗脑胶质瘤的机制进行了探讨。为化合物3r成为一种新型靶向抑制剂用于脑胶质瘤治疗提供了理论与实验依据,对系列吲哚类化合物进一步的修饰合成开发提供新的思路。