NLRP3是细胞质中一种重要的模式识别受体,是NOD样受体家族成员之一。NLRP3炎症小体由NLRP3、Pro-caspase-1和ASC构成,与多种炎症性疾病密切相关,是一个很有前景的治疗炎症相关疾病的药物开发靶点。炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种免疫系统介导的慢性疾病,其特点是胃肠道发病率和复发率高,严重影响患者的生活质量,显著增加结肠癌的风险。IBD的发生与NLRP3炎症小体密切相关,靶向抑制NLRP3炎症小体的激活可能是治疗IBD的有效策略。急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是一种严重的呼吸系统疾病,其特征为肺泡损伤、严重低氧血症、严重炎症反应和细胞因子积累,具有较高的发病率和死亡率。中性粒细胞胞外陷阱(Neutrophil extracellular traps,NETs)在ALI的发展进程中发挥着重要的作用,而NLRP3炎症小体的激活可以促进NETs的形成,因此,靶向抑制NLRP3炎症小体的激活以减少NETs的形成,可能是一种治疗ALI的有效策略。冬凌草甲素(Oridonin,Ori)是一种从冬凌草中分离出来的对映-贝壳杉烷型四环二萜类化合物。据报道,Ori是NLRP3炎症小体的特异性共价抑制剂,通过与NLRP3 NACHT结构域的279位半胱氨酸形成共价键,阻断NLRP3与NEK7的相互作用,从而抑制NLRP3炎症小体的组装和活化。此外,Ori通过抑制NLRP3炎症小体的活化,对腹膜炎、痛风性关节炎和2型糖尿病等小鼠模型具有一定的预防或治疗作用,具有成为治疗NLRP3炎症小体相关疾病先导化合物的潜能。然而,目前对于Ori构效关系的研究大多数集中在抗肿瘤活性上,其作为NLRP3抑制剂的结构优化尚未见报道。因此,本课题将以Ori作为先导化合物,设计、合成一系列Ori衍生物,并首次进行其作为NLRP3抑制剂的活性研究,以期得到结构新颖、高效低毒的Ori衍生物,为有效治疗包括IBD和ALI在内的NLRP3炎症小体相关疾病提供潜在的先导化合物。方法:1.冬凌草甲素衍生物的设计、合成及其初步构效关系研究基于新药设计中的分子杂交原理,在Ori反应活性较好的14-OH引入不同取代的α,β-不饱和酯或氨基甲酸酯活性片段,合成目标化合物。通过核磁共振氢谱(~1H NMR)、核磁共振碳谱(~(13)C NMR)以及高分辨质谱(HRMS)来确定所有化合物的结构。THP-1细胞经PMA刺激后分化为巨噬细胞THP-M。先用LPS刺激THP-M细胞4.5 h,再用ATP刺激30 min(LPS+ATP),激活NLRP3炎症小体,引起IL-1β的大量分泌。通过CCK-8法分析化合物对THP-M的细胞毒性。通过酶联免疫吸附试验检测经LPS+ATP刺激后的THP-M细胞IL-1β的分泌量,评估化合物对NLRP3炎症小体的抑制活性。根据化合物的毒性与活性数据进行初步构效关系评价,得到具有进一步探究价值的目标化合物(化合物E6)。使用液质联用仪分析化合物E6的纯度。2.化合物E6对NLRP3炎症小体的的抑制作用及其作用机制通过CCK-8法和酶联免疫吸附试验进一步分析化合物E6对THP-M的细胞毒性和对NLRP3炎症小体的抑制活性,以得到细胞毒性IC_(50)和抑制IL-1β分泌的IC_(50),并进一步得到化合物E6的选择指数。通过蛋白质印迹法和酶联免疫吸附试验检测NLRP3炎症小体活化过程中相关蛋白的表达水平来探究化合物E6对启动阶段和活化阶段的影响。通过检测化合物E6对不同刺激剂(ATP、Nigericin或MSU晶体)引起的NLRP3炎症小体活化以及对不同炎症小体(NLRP3、AIM2或NLRC4炎症小体)活化的影响来评估化合物E6抑制NLRP3炎症小体活化的特异性。通过细胞热转移实验分析化合物E6与NLRP3的结合效率。通过分子对接探究化合物E6与NLRP3的结合模式。通过检测经LPS+ATP刺激后的THP-M细胞LDH的释放量、细胞焦亡率、PI阳性染色率来探究化合物E6对细胞焦亡的抑制作用。通过蛋白质印迹法检测细胞焦亡过程中相关蛋白的表达水平来探究化合物E6抑制细胞焦亡的机制。3.化合物E6对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗作用在饮用水中添加DSS诱导小鼠发生结肠炎,并以腹腔注射给药的方式处理小鼠。根据小鼠体重减变化、粪便稠度、便血情况、结肠长度变化来评估小鼠结肠炎的严重程度。通过H&E染色、AB-PAS染色分析小鼠结肠的组织病理学变化。通过免疫组化和蛋白质印迹法检测结肠组织中NLY-188011溶解度LRP3炎症小体活化相关蛋白的表达水平,初步探究化合物E6缓解小鼠结肠炎的分子机制。4.冬凌草甲素衍生物F1抑制中性粒细胞胞外陷阱形成的初步研究根据新药设计中的分子杂交原理,在Ori的14-OH引入异氰酸环己酯,得到化合物F1。通过~1H NMR、~(13)C NMR以及HRMS来确定化合物F1的结构。使用中性粒细胞分离液试剂盒提取小鼠骨髓来源的中性粒细胞,并通过流式细胞术鉴定中性粒细胞的纯度。通过酶联免疫吸附试验探究化合物F1对Nigericin刺激后的中性粒细胞分泌IL-1β的影响。通过免疫荧光探究化合物F1对Nigericin诱导的NETs的抑制作用。腹腔注射给药30 min后,通过滴鼻的方式用LPS诱导小鼠发生急性肺损伤;LPS刺激12 h后,处死小鼠,取出肺部组织进行H&E染色。结果:1.设计并合成了29个结构新颖、未见报道的Ori衍生物,所有化合物的结构通过~1H NMR、~(13)C NMR以及HRMS得到了确证。其中,化合物E6对IL-1β表现出较强的抑制活性以及较大的选择指数(抑制IL-1β分泌的IC_(50)=0.45±0.02μM,选择指数SI=36.49)。与Ori(抑制IL-1β分泌的IC_(50)=5.18±0.10μM,选择指数SI=5.04)相比,化合物E6的抑制活性和选择指数分别提高了11.5倍和7.2倍。2.化合物E6对NLRP3炎症小体活化的启动阶段没有影响,但能显selleck diABZI STING agonist著抑制其激活阶段。化合物E6显著抑制了不同刺激剂(ATP、Nigericin或MSU晶体)引起的NLRP3炎症小体活化,但不能抑制AIM2、NLRC4炎症小体的活化。化合物E6可以与NLRP3结合,其结合效率和亲合力高于Ori。化合物E6显著抑制了经LPS+ATP刺激后的THP-M细胞释放LDH,减少了细胞焦亡率、PI阳性染色率。化合物E6有效逆转了LPS+ATP刺激引起的THP-M细胞GSDMD、GSDMD-NT和Caspase-1表达的增多。同时,化合物E6也有效逆转了胞转LPS刺激引起的THP-M细胞GSDMD、Pro-caspase-4、GSDMD-NT以及Caspase-4表达的增多。3.小鼠经DSS处理后,出现体重减轻、大便稀、便血的症状,疾病活动指数显著升高。同时,DSS组小鼠的存活率降低,结肠显著缩短。而经过化合物E6(10 mg/kg或5 mg/kg)处理后,小鼠的结肠炎症状得到了有效的缓解,且效果优于Ori(10 mg/kg)。此外,DSS组小鼠的结肠发生了组织病理学变化(包括杯状细胞减少、黏液分泌异常、隐窝坏死和炎性细胞浸润),肠壁屏障受损。而给予化合物E6(10 mg/kg或5 mg/kg)处理后,小鼠结肠的组织病理学变化受到了明显的抑制,且抑制效果优于Ori(10 mg/kg)。DSS组小鼠结肠组织中IL-1β、Caspase-1以及TNF-α的表达明显增多,而化合物E6(10mg/kg或5 mg/kg)能显著抑制这些蛋白的表达。化合物E6在人和大鼠肝微粒体中的消除半衰期(T_(1/2))分别为53.4 min和31.8 min。化合物E6在SD大鼠体内的药代动力学参数:消除速率常数(Kel)为0.107±0.0221 h,半衰期(T_(1/2))为6.64±1.15 h,清除率(CL)为105±22.4 m L/kg/min,稳态表观体积分布(Vd_(ss))为23.1±4.00 L/kg。4.设计并合成了化合物F1,其结构通过~1H NMR、~(13)C NMR以及HRMS得到了确证。中性粒细胞经Nigericin刺激后,IL-1β的分泌显著增多,而化合物F1显著抑制了IL-1β的分泌,且抑制效果优于Ori。经Nigericin处理后的中性粒细胞出现细胞核分叶状消失、细胞核变圆,染色质解聚并扩张、形成网状染色质结构等现象,并观察到Cit-H3与DNA的共定位,NETs的形成显著增多。给予化合物F1(0.5μM或2μM)处理后,中性粒细胞染色质扩张程度降低,网状染色质结构、Cit-H3与DNA的共定位以及NETs的形成均显著减少。而给予Ori(2μM)处理后,由Nigericin引起的这些现象不能得到有效的逆转。化合物F1(20 mg/kg)能有效减少LPS滴鼻刺激引起的小鼠肺部炎性细胞浸润和肺泡的出血性损伤。结论:1.在Ori的14-OH引入α,β-不饱和酯或氨基甲酸酯片段对化合物的抑制活性和细胞毒性有着重要的影响。在Ori的14-OH引入α,β-不饱和酯或二苯基取代氨基甲酸酯片段得到的化合物的抑制活性和细胞毒性会同步提升,而引入具有苯环取代氨基甲酸酯片段的化合物具有高效低毒的特性。2.化合物E6通过靶向结合NLRP3特异性地抑制NLRP3炎症小体的活化,并可通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡途径和Caspase-4/GSDMD焦亡途径来抑制IL-1β的分泌和细胞焦亡。3.化合物E6对DSS诱导的小鼠结肠炎具有治疗作用,其作用机制与抑制NLRP3炎症小体的活化有关。同时,化合物E6在人肝微粒体中具有较好的代谢稳定性,在SD大鼠体内具有可接受的药代动力学特性。因此,oncology access化合物E6具有成为治疗包括IBD在内的NLRP3炎症小体相关疾病先导化合物的潜能。4.化合物F1能有效抑制Nigericin诱导的NETs的形成,其作用机制可能与抑制NLRP3炎症小体的活化有关。同时,化合物F1可能对LPS诱导的小鼠急性肺损伤具有治疗作用。