眼前节结构指眼球中晶状体及晶状体前部的所有眼部组织,包括角膜、睫状肌、虹膜、结膜以及玻璃体等结构。眼前节结构异常主要包括角膜浑浊、瞳孔异位、角膜和虹膜及晶状体之间有粘连等症状。EDICT综合征是一种常染色体显性遗传病,属于眼前节结构异常的一种,主要表现为角膜内皮营养不良、虹膜发育不全、白内障以及角膜基质变薄。EDICT综合征首次发现于一瑞典家系中,该家系患病成员通常同时患有白内障和角膜粘连,角膜呈现间质变薄的现象,患病严重程度有个体差异性。遗传分析发现该病是由micro RNA-184(miR-184)种子区发生单碱基突变(c.57 C>T)所致。之后,在北爱尔兰一家系中也发现miR-184种子区单碱基突变(c.57 C>T),家系患病成员也出现了白内障症状,但与瑞典家系不同的是,该家系患病成员出现圆锥形角膜症状。此外,在散发圆锥形角膜患者中发现miR-184的另外两个突变(+8C>A,+3A>G)。这表明miR-184突变导致的眼前节结构发育异常具有显著的临床异质性,其在眼前节结构发育中的作用机制尚不清楚。因此,构建miR-184动物模型有助于我们认识miR-184在眼前节结构发育中发挥的作用,阐明miR-184突变在眼前节结构发育异常中的分子机制,能够为研究靶向治疗药物提供理论基础和新的思路。实验室前期使用CRISPR/Cas9基因编辑技术同时敲除了斑马鱼中产生成熟miR-184的两个基因dre-miR-184-1和dre-miR-184-2,使用Real-Time PCR确定了miR-184~(-/-)斑马鱼中成熟miR-184的缺失,成功构建了miR-184敲除斑马鱼。前期对表型进行了简单分析,但其表型仍需进一步明确,分子机制需要探究。为确认miR-184~(-/-)斑马鱼小眼畸形表型,我们对7 dpf、14 dpf及成年野生型和miR-184~(-/-)斑马鱼进行活体拍照并统计眼睛大小。同时对1月龄和2月龄的野生型和miR-184~(-/-)斑马鱼眼球进行石蜡切片H&更多E染色,实验结果显示与野生型斑马鱼相比,miR-184~(-/-)斑马鱼眼睛从2月龄开始出现小眼畸形表型,眼睛大小随年龄的增加差异更加明显。为了确定敲除miR-184之后斑马鱼的角膜是否出现异常,我们使用AS-OCT以及宏观变倍显微镜活体观察野生型和miR-184~(-/-)斑马鱼的眼前节结构,AS-OCT及活体观察结果显示与野生型斑马鱼相比,miR-184~(-/-)斑马鱼的晶状体变小,但是未观察到其出现明显的角膜前扩张、圆锥形角膜或者虹膜异常等问题。我们对比2.5月龄、5月龄和12月龄野生型与miR-184~(-/-)斑马鱼角膜上皮细胞及基质层的厚度,未发现有明显异常。以上结果说明敲除miR-184不影响斑马鱼的角膜结构及其发育。为确认miR-184~(-/-)斑马鱼白内障表型,我们使用裂隙灯观察了12月龄年野生型和miR-184~(-/-)斑马鱼晶状体。结果发现与12月龄野生型相比,miR-184~(-/-)斑马鱼晶状体出现浑浊。晶状体网格成像也表明敲除miR-184会导致斑马鱼白内障chemical pathology。我们进一步研究发现3 dpf的miR-184~(-/-)斑马鱼晶状体中的细胞核和线粒体降解无异常,说明miR-184~(-/-)斑马鱼晶状体终末分化正常。我们发现miR-184~(-/-)斑马鱼晶状体中晶状体蛋白γ-crystallinBlebbistatin异常聚集,晶状体骨架蛋白F-actin排列紊乱,这可能是miR-184~(-/-)斑马鱼出现白内障的原因之一。敲除miR-184之后斑马鱼出现小眼畸形表型,研究发现miR-184~(-/-)斑马鱼视杯中的增殖细胞减少,细胞凋亡无明显变化,进一步研究发现视杯和晶状体中p21表达量显著上调,且不依赖于p53。视杯组织中p21表达量上调,细胞周期阻滞,视杯增殖细胞数减少可能是miR-184~(-/-)斑马鱼出现小眼畸形的原因。miR-184~(-/-)斑马鱼晶状体中纤维化基因表达上调,晶状体具有纤维化趋势,抑制P21活性可显著下调纤维化基因表达。该结果提示,P21高表达导致晶状体纤维化可能是miR-184~(-/-)斑马鱼白内障发生的另一原因。为了探讨miR-184调控的下游基因情况,我们进行了野生型和miR-184~(-/-)斑马鱼眼球RNA转录组分析和双荧光素酶报告实验。转录组结果显示敲除miR-184之后斑马鱼眼睛中有466个基因表达水平升高和489个基因表达水平下降,其中细胞生长和凋亡相关基因表达水平下降,晶状体蛋白相关基因表达上调。并且在miR-184~(-/-)斑马鱼眼中使用q RT-PCR验证了转录组的结果,同时发现能够抑制p21表达的四种转录因子Hsf4、Sox9a、Ctcf和Smad6a的表达水平均降低。另外,双荧光素酶报告实验筛选出miR-184的直接下游靶点Mybl1、Atp1a3a、Phox2bb、Ampd2a、Nck2a、Akap1b、C1orf174和Ppp6r2b。使用3月龄miR-184~(-/-)斑马鱼晶状体和视杯组织RNA进行验证,发现Atp1a3a、Nck2a、Akap1b和Ampd2a在miR-184~(-/-)斑马鱼晶状体中表达量上调,各基因在视杯组织中的表达量无明显差别。总之,我们的结果表明miR-184通过调控p21表达参与眼前节结构发育,该发现帮助我们了解miR-184在眼前节结构发育中发挥的作用,同时为明确miR-184突变导致眼前节结构发育异常的致病机制提供新的思考方向。