L-精氨酸(L-arginine)是一种半必需氨基酸,在饲料、食品、化妆品以及医药等领域均有广泛应用。目前L-精氨酸的主要生产方式是较为经济、环保的微生物发酵法,利用多种糖类作为碳源。碳源的利用效率影响着最终L-精氨酸的产量,而且碳源占总发酵生产成本比重较大,如何使钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)利用糖类高效生产L-精氨酸成为当前亟待改进的问题。因此,本论文以实验室前期构建的一株L-精氨酸高产菌株钝齿棒杆菌MT-M4ΔTSCPΔptaΔpro BΔcgl2310Δncgl1221(CCM01)为初始菌株,利用基因工程手段系统重构糖代谢途径以期进一步提高碳源利用率,促进L-精氨酸的生产。主要研究内容如下:1.重构钝齿棒杆菌葡萄糖转运途径。采用插入强启动子Peftu的方式过表达PTS系统葡萄糖特异性转运蛋白编码基因pts G,构建菌株CCM02。RT-PCR结果显示该基因转录水平提高1.67倍,摇瓶发酵结果表明该菌株葡萄糖消耗量增加8.51%,L-精氨酸产量增加13.12%。过表达IPGS系统肌醇透性酶编码基因iol T1、葡萄糖激酶Ppg K编码基因cg2091,敲除负调控蛋白编码基因iol R,构建IPGS系统强化菌株CCM05。该菌株生长受到抑制,L-精氨酸产量明显下降。下一步叠加强化PTS系统和IPGS系统,构建菌株CCM06。摇瓶发酵结果显示CCM06的葡萄糖消耗量较初始菌株增加11.2%,L-精氨酸产量提高23.35%。最后为使更多的PEP流向L-精氨酸合成途径,尝试敲除pts G,同时强化IPGS系统,构建菌株CCM07。摇瓶发酵结果显示PTS系统失活后,IPGS系统无法恢复菌株的糖吸收能力,菌体生长受到影响,L-精氨酸产量下降。因此以菌株CCM06为初始菌株进行后续实验。2.优化钝齿棒杆菌蔗糖利用途径。在成功提高葡萄糖的转运效率后,优Navitoclax NMR化钝齿棒杆菌的碳源,利用更为经济高效的葡萄糖蔗糖混合糖为碳源。为加大对蔗糖的利用效率,重构果糖转运途径。敲除PTS系统果糖特异性转运蛋白编码基因pts F,再将pts G第260位甲硫氨酸突变为缬氨酸构建菌株CCM09,使果糖通过Pts G进入细胞。摇瓶发酵结AZD9291果显示CCM09的L-精氨酸产量明显下降。之后尝试引入大肠杆菌果糖激酶编码基因mak,以抑制果糖出胞,节省胞内PEP。结果显示胞内NADPH含量增加,L-精氨酸产量有所增加,但是ATP含量下降,菌体生长量略有下降。3.改造钝齿棒杆菌糖酵解途径。引入外源果糖激酶编码基因mak后,菌体生长受到抑制。考虑是因为外源果糖激酶以ATP为磷酸供体,过多消耗胞内ATP影响细胞生长。因此敲除编码基因pfk B1、pfk B2构建菌株CCM11、CCM12,再叠加敲除构建菌株CCM13。以期果糖-1-磷酸激酶的敲除能增加胞内果糖-1-磷酸的积累,从而刺激糖酵解代谢通量的提高以促进菌体生长,同时提高底物水平磷酸化促进ATP的产生。结果显示ATP含量和菌体生长量均有所上升,但L-精氨酸产量均有不同程度的下降。之后过表达糖酵解通路磷酸果糖激酶编码基因pfk A和丙酮酸激酶编码基因pyk,分别构建菌株CCM14、CCM15。结果显示菌株CCM14胞内ATP含量上升,部分恢复mak基因过表达对细胞生长的抑制,且L-精氨酸产量较CCM10提高16.13%。菌株CCM15则破坏了菌体生长与生产之间的代谢平衡,L-精氨酸产量下降8.72%。4.调控钝齿棒杆菌的糖代谢转录调节因子。最后,对糖代谢的全局转录因子Sug R及Fru R进行敲除,分别构建菌株CCM16、CCM17。摇瓶发酵结果显示菌株CCM16的L-精氨酸产量提高13.42%,菌株CCM17菌体生长受到抑制,L-steamed wheat bun精氨酸产量也下降。对糖代谢通路进行系统改造后,菌株CCM16的L-精氨酸产量为18.32 g/L,较CCM01提高了93.45%。菌体生长量为6.45 g/L,较出发菌株提高5.39%。菌株CCM16的单位精氨酸产量也提高了78.62%。本研究为糖代谢改造提高L-精氨酸生物合成提供了理论基础,为重要的工业工程菌——钝齿棒杆菌高效利用碳源提供了参考和依据。