人类听觉感知具有高度的敏感性和精确性,复杂的耳蜗结构及完整的神经回路是听觉感知的基础。哺乳动物出生后早期耳蜗不成熟,需要经历一系列结构的重塑,建立完整的听觉通路。在此期间,由于无法感知外界声音,不能产生声音诱导的神经活动。但是,仍可在听觉通路上检测到爆发式的电活动,这对早期耳蜗的成熟和听觉通路的建立至关重要。研究表明,早期自发性电活动起源于耳蜗K(?)lliker器支持细胞,这类细胞可通过半通道自发性释放三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)并激活嘌呤信号系统,促使临近的内毛细胞(inner hair cells,IHCs)去极化,释放神经递质谷氨酸,进一步兴奋螺旋神经元产生神经冲动向上传导。但是,目前,尚不完全清楚支持细胞释放ATP的启动因素是什么,ATP释放的动态过程受哪些分子机制调控也尚未阐明。ATP在线粒体中合成,因此,在自发性电活动的研究中,线粒体的作用非常重要。端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)为端粒酶的限速酶,可通过端粒依赖的作用调控细胞的增殖,因此,在增殖活性较高的细胞中,比如胚胎期细胞、肿瘤IACS-10759体内细胞和成体干细胞等,TERT表达也较高。但在出生后的啮齿类动物中,TERT仍继续表达,发挥作用。除了具有端粒依赖的作用,该蛋白还可发挥非端粒依赖作用。由于有核输出信号和核定位信号,TERT可以动态穿梭于不同的亚细胞器之间。一般情况下,该蛋白主要集中在细胞核,只有少部分位于线粒体中,但是在各种损伤因素作用下,TERT可大量转位到线粒体,保护线粒体功能,减少活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的产生,保护线粒体DNA,减少细胞损害和凋亡。此外,研究发现过表达TERT还可增加线粒体的膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)和细胞内Ca~(2+)的储存能力。综上所述,在各种损伤及病理刺激下,TERT转移到线粒体并保护其功能,具有重要的生物学意义。TERT的端粒依赖作用可调控增殖,促进生长发育,那么TERT的非端粒依赖作用是否参与调控组织器官的生长发育呢?有研究发现TERT可通过非端粒依赖途径调控海马神经元的存活和成熟,虽然其具体机制尚不明确,但为非端粒依赖的TERT参与调节组织发育提供了依据。那么,TERT是否能够调节听觉系统的发育呢?如果能,又是通过哪些机制来调节的呢?回顾文献,尚未见TERT在内耳发育中作用的报道。实验一出生后早期小鼠耳蜗TERT的表达和亚细胞定位分析目的分析TERT在出生后早期小鼠耳蜗和体外培养耳蜗支持细胞的表达及亚细胞定位情况。方法新生C57BL/6J仔鼠按出生后的天数分为P1、P4、P7和P10四组,取小鼠耳蜗进行冰冻切片,然后进行免疫荧光染色,分析TERT的表达情况,并进行细胞核定位分析;取新生鼠(P0-2)耳蜗基底膜,消化分离耳蜗支持细胞,体外培养D1、D4、D7和D10,免疫荧光染色和Western Blot检测来观察TERT的表达情况,标记线粒体,分析TERT与线粒体是否共定位。采用免疫荧光染色的方法分析支持细胞体外培养期间,氧化应激及凋亡的发生情况。结果1.TERT在出生后早期(P1、P4、P7和P10)的小鼠耳蜗底、中转和顶转均有表达,且在各转支持细胞表达最显著;对TERT的核质分布情况分析,P1和P4,该蛋白主要位于支持细胞的细胞核内,P7小鼠耳蜗TERT部分位于支持细胞的细胞质中,P10小鼠耳蜗TERT主要位于支持细胞的细胞质中。2.TERT在体外培养的耳蜗支持细胞体中持续表达,D1-D4天,该蛋白主要位于支持细胞的细胞核中,随后开始核外转位,D7天,TERT较均匀的分布在核质中,随后TERT继续向核外转位,D10天,TERT基本上转位到细胞质中;通过对TERT和线粒体的共定位分析,结果显示,D7和D10,移位到细胞质中的TERT与线粒体共定位良好,皮尔逊相关系数r分别为0.63±0.03和0.71±0.02。3.对细胞的损伤和凋亡进行检测,结果发现耳蜗支持细胞体外培养期间(D1-D10),ROS、Caspase3和TUNEL水平没有发生明显的增加。结论1.TERT在出生后早期耳蜗支持细胞中表达,并逐渐向核外线粒体移位。2.耳蜗支持细胞体外培养时无明显的氧化应激和凋亡的发生,TERT的核外线粒体转位发挥非抗氧化和抗凋亡作用。实验二TERT转位期间支持细胞线粒体功能变化和嘌呤信号激活的检测目的分析耳蜗支持细胞TERT转位过程中线粒体功能变化及嘌呤信号激活情况。方法取新生C57BL/6J仔鼠(P0-2)耳蜗基底膜,消化分离获取耳蜗支持细胞,体外培养D1、D4、D7和D10,检测MMP和细胞内ATP浓度变化以评估线粒体功能变化,检测细胞外ATP和细胞内Ca~(2+)浓度以评估嘌呤信号系统的激活变化。通过免疫荧光,分析MMP变化;采用比色法,检测支持细胞内外ATP的浓度;采用钙成像技术,分析细胞内Ca~(2+)浓度。结果1.MMP检测结果显示:相比于D1和D4,D7和D10支持细胞MMP逐渐升高;细胞内ATP浓度检测结果显示:D1和D4时,细胞内ATP浓度均处于较低水平,但在D7时,细胞内ATP浓度明显升高,在D10时,细胞内ATP浓度进一步升高。2.细胞外ATP浓度检测结果显示:D1和D4时landscape dynamic network biomarkers,细胞外ATP浓度均处于较低水平,在D7时,细胞外ATP浓度明显升高,在D10时细胞外ATP浓度进一步升高。钙成像结果显示,D7和D10的Ca~(2+)细胞信号强度比D1和D4更明显,此外,D7和D10的Ca~(2+)波持续时间更长。结论1.耳蜗支持细胞体外培养时,线粒体的ATP的合成、释放和嘌呤信号的激活增加。2.线粒体功能变化、嘌呤信号系统的变化与TERT向核外线粒体移位的变化趋势具有一致性,TERT可能参与嘌呤信号系统的激活。实验三TERT线粒体移位对耳蜗结构和功能的影响目的探究TERT线粒体移对小鼠耳蜗结构和功能的影响方法采用基因编辑技术构建TERT基因敲除模型小鼠,并与Lgr5-Cre ER~(+/+)工具鼠进行杂交,基因型TERT~(fl/fl-Lgr5Cre ER-/+)的小鼠作为实验组,同窝的TERT~(+/+-Lgr5Cre ER-/+)小鼠作为对照组,通过腹腔注射他Tamoxifen诱导选择性敲除耳蜗支持细胞的TERT基因,然后分别于出生后14天和28天进行ABR检测(Click、4K-32K Hz),并通过冰冻切片和免疫荧光染色,分析小鼠耳蜗结构的变化。结果1.免疫荧光染色结果显示,通过腹腔注射Tamoxifen,实验组小鼠的耳蜗支持细胞中不表达TERT蛋白,而在对照组中仍正常表达,模型建立成功。2.分别从P4和P7开始诱导敲除,然后mTOR抑制剂在14天和28天进行ABR检测,结果发现,各实验组14天和28天的ABR阈值明显高于相应的对照组,差异有统计学意义;各实验组14天和28天的ABR阈值结果进行组间比较,结果显示,P14测听时,P4和P7诱导的实验组ABR阈值差异无统计学意义,P28测听时,P4诱导敲除实验组ABR阈值高于P7组,差异有统计学意义,提示消除TERT线粒体转位可以影响小鼠耳蜗的功能。3.P4诱导敲除后,取P28天小鼠耳蜗,通过免疫荧光染色的方法标记螺旋神经元,结果发现实验组耳蜗的顶转和中转螺旋神经元的数量较对照组减少,差异有统计学意义,提示消除TERT线粒体移位,可影响耳蜗螺旋神经元的存活和成熟。结论TERT核外线粒体移位参与调控出生后早期小鼠耳蜗螺旋神经元的存活和成熟,进而影响小鼠耳蜗的功能。