拟态弧菌(Vibrio mimicus)常见于各种水环境中,是引起水生生物弧菌病的重要病原菌,同时可感染人类,引发腹泻和败血症。PrtV基因编码含多囊肾病(Polycystic Kidney Disease,PKD)结构域的金属蛋白酶infection (neurology),存在于霍乱弧菌(V.cholerae)、Entinostat IC50副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarumPexidartinib半抑制浓度)与溶珊瑚弧菌(V.coralliilyticus)等多种弧菌中,介导细胞毒性和溶血性,同时对细菌的入侵与转移具有重要的作用。在对黄颡鱼源拟态弧菌强毒株SCCF01全基因组分析中发现其存在与霍乱弧菌PrtV基因具有83%相似性的PrtV基因,为揭示其在拟态弧菌感染与致病过程中的作用,开展了以下研究:以拟态弧菌SCCF01野生株为出发菌,采用重叠延伸PCR获得4600 bp含Kana抗性基因的打靶片段,并进行电转化构建SCCF01/p KD46重组菌,再通过自然转化(Natural transformation)与λ-Red重组酶系统相结合的方法获得PrtV基因缺失的阳性转化子,挑取具有Kana抗性的单菌落进行PCR验证,最后利用p CP20质粒的FLP/FRT(flippase recombination enzyme/recognition target)位点特异性重组系统将Kana抗性基因剔除后成功构建拟态弧菌PrtV基因缺失株(ΔPrtV);通过PCR扩增出2757 bp的PrtV基因全长,再进行一步法同源重组构建高拷贝重组表达质粒p BAD24,电转化将质粒导入缺失株后采用菌落PCR进行验证,成功构建基因回补株(ΔPrtV/p PrtV),为后续基因功能解析奠定了基础。为探究PrtV基因对拟态弧菌表型的影响,对SCCF01野生株、缺失株ΔPrtV和回补株ΔPrtV/p PrtV进行菌落形态、形态学特性、生长曲线、生理生化特性、生物被膜形成和自聚集能力等进行比较分析,发现与SCCF01野生株和回补株ΔPrtV/p PrtV相比,缺失株ΔPrtV分解甘氨酸、香豆酸盐、鸟氨酸和赖氨酸的理化特性发生改变;而菌落形态、形态学特性、生长特性、生物被膜形成、自聚集能力无明显变化。为揭示PrtV基因对拟态弧菌致病相关特性的影响,对SCCF01野生株、缺失株ΔPrtV和回补株ΔPrtV/p PrtV进行细胞黏附特性、溶血活性、细胞毒性、胞外产物酶活性、对宿主细胞因子表达影响、致病性及病理损伤差异进行分析,发现与SCCF01野生株和回补株ΔPrtV/p PrtV相比,缺失株ΔPrtV对EPC细胞的黏附力无明显差异,但溶血活性明显减弱,同时对EPC和CCK细胞的毒性作用显著降低(P<0.05),蛋白酶和脲酶活性显著降低(P<0.05),而卵磷脂酶活性无明显差异;ELISA结果显示,缺失株ΔPrtV的胞外产物作用CCK细胞后TNF-α和IL-8的表达显著低于SCCF01野生株和回补株ΔPrtV/p PrtV(P<0.05),而IL-6、TGF-β1、IL-1α和IL-1β的表达相较于SCCF01野生株和回补株ΔPrtV/p PrtV无明显变化;在杂交鲇的致病性试验中,SCCF01野生株和缺失株ΔPrtV对杂交鲇14 d内的半数致死量(LD_(50))分别为5.32E+03CFU/m L和5.32E+04 CFU/m L,缺失株ΔPrtV毒力减弱10倍;选取浓度为1.00E+04的SCCF01野生株和缺失株ΔPrtV攻毒后杂交鲇的皮肤组织进行Masson染色,发现SCCF01野生株对皮肤胶原纤维的破坏更加严重,表明拟态弧菌PrtV基因编码的金属蛋白酶与其感染造成的皮肤损伤有关。综上,PrtV基因对拟态弧菌毒力具有重要作用,主要通过调节溶血性、细胞毒性、酶活性和炎性因子的分泌等致病相关特性介导其毒力。