真空冷冻干燥作为最常用的菌种保藏方法,已被广泛应用于乳酸菌发酵剂的工业化生产中,但干燥过程中菌体仍不可避免的受到低温、酸、脱水和氧化等多种不利因素的影响,造成菌体损伤甚至死亡。目前,对真空冷冻干燥过程中氧化应激导致细胞损伤和活力降低的研究鲜有报道。本研究以乳双歧杆菌Probio-M8作为研究对象,从乳清蛋白水解物中分离得到的抗氧化肽HP3-2作为冻干保护剂,探究真空冷冻干燥过程中氧化应激对细胞膜结构和生物学特性的影响,以及在不同冻干保护剂作用下乳双歧杆菌Probio-M8的差异蛋白表达,从细胞分子水平和生理变化上共同揭示抗氧化肽HP3-2在真空冷冻干燥过程中对乳双歧杆菌Probio-M8细胞的保护机制。具体研究结果如下:(1)相较于中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶,碱性蛋白酶对乳清蛋白的水解度较高(31.74%),且水解产物具有较强的抗氧化活性。将水解产物作为冻干保护剂可使乳双歧杆菌Probio-M8在真空冷冻干燥及贮藏过程中具有较高的菌种存活率(>72%),能够降低细胞内活性氧的积累和氧化产物丙二醛的含量,减少贮藏过程中温度和时间的变化对菌体失活速率的影响,提高菌种的贮藏稳定性。(2)使用超滤、离子交换层析、反向高效液相色谱以及液相色谱质谱联用技术对乳清蛋白水解物中的抗氧化肽进行分离、纯化和鉴定。结果发现,分子量<2k Da并且由丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)等多种疏水性氨基酸组成的抗氧化肽HP3-2,具有较高的DPPH清除率(88.11±0.38%)、氧自由基吸收能力(2.73±0.10μmol TE/g)和超氧阴离子吸收能力(62.54±3.16U/L),相较于乳清蛋白水解物,分离纯化后所获得的抗氧化肽HP3-2在真空冷冻干燥过程中对乳双歧杆菌Probio-M8具有更强的保护作用。(3)通过平板计数、气相色谱CL 318952作用质谱联用和流式细胞术等技术,对乳双歧杆菌Probio-M8的细胞膜结构、细胞膜内外离子浓度以及细胞活力进行测定。结果发现,抗氧化肽HP3-2能够降低真空冷冻干燥过程中细胞的内活性氧及丙二醛含量(2.14±0.06nmol/m L),使细胞膜中的不饱和脂肪酸维持较高的相对含量(51.49±1.26%),维持细胞膜流动性、细胞膜电位以及跨膜离子浓度(Na~+、H~+),保护F6PPK(50.41±1.68IU/g)和K~+Na~+-ATPase(5.26±0.08U/g)酶的活性,维持细胞内环境的稳态,使乳双歧杆菌Medical sciencesProbio-M8在真空冷冻干燥过程中具有较高的菌种存活GNE-140率(80.40%±3.34)以及细胞活力。(4)使用TMT定量蛋白质组学技术对乳双歧杆菌Probio-M8在真空冷冻干燥过程中的蛋白质表达进行分析,结果发现,添加冻干保护剂能够保护细胞内核糖体蛋白,刺激蛋白质的翻译合成,其中,抗氧化肽HP3-2还能够提高细胞内烟酰胺核苷酸氨基水解酶家族蛋白、磷酸核酮糖3-差向异构酶和Ppx/Gpp A家族磷酸酶的表达,促进核苷酸代谢和碳水化合物代谢,提高乳双歧杆菌Probio-M8的抗逆性以及抗氧化能力,降低氧化应激对细胞的损伤。本研究的开展为真空冷冻干燥过程中氧化应激反应对乳双歧杆菌Probio-M8的细胞损伤机制提供理论依据,为新型冻干保护剂的开发以及发酵剂和乳酸菌制品的工业化生产提供新的方法与思路。