阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病,至今仍无法根治。β-淀粉样蛋白聚集体,尤其是寡聚体(Aβ42O在脑中的积累,已被确认为是引起AD的主要病理因素之一。催化性抗体既具有免疫活性还能催化靶向抗原进行一定的化学反应。所以,抗Aβ42聚集体的催化性抗体要比单纯的抗体能更有效地清除Aβ42O基于上述的理论基础和我们之前的研究结果,本论文从人单链抗体库中筛选出的一种抗Aβ42O催化性单链抗体,并对该催化性抗体的结构、性质及其体内外抗Aβ42的功效进行了研究,取得的主要研究结果如下:1.筛选出的催化性单链抗体HS72(重链126个氨基酸,轻链109个氨基酸)与已报道的单链抗体HT7仅有2个氨基酸残基的差异(HS72的Asp45、His241对应HT7的Gly45、Gly241)。应用免疫印迹(western blot)和酶联免疫吸附法(ELISA)确定了HS72对Aβ42O和原纤维(Aβ42P)具有特异性,且其结合的Aβ42O的分子量范围(约14-68kDa)明显宽于HT7(23-55 kDa)。2.通过ELISA、western blot、高效液相(HPLC)法定义了HS72催化Aβ42聚集体降解的能力。在与HS72孵育10天后,Aβ42单体(Aβ42M)、寡聚体(Aβ42O)和纤维(Aβ42F)体系中的总Aβ水平分别下降了约4.0%(由Aβ42M聚集成Aβ42O所致)、11%和5.8%,而同时均产生了 N-端和C-端截短的Aβ片段,与此同时,均有相应数量的Aβ42M也从Aβ42聚集体中解离出来。相比之下,HT7对Aβ42聚集体无催化作用。这些结果证明了HS72不但能催化Aβ42聚集体的降解,而且生成的产物也具有安全性。基于HS72与HT7一VX-661配制级结构的相似性,应用硫磺素T染色法(ThT-F)分别测定了HS72、HT7与四种形式的Aβ42孵育48h后Aβ42聚集程度的变化,结果表明,作用12h后,HS72降低上述四种Aβ42聚集的作用显著高于HT7,这显然与HS72的双重功效有关,即HS72除了具有与HT7相似的抑制Aβ42M聚集并诱导Aβ42聚集体解聚的功效外,HS72还具有催化Aβ42O降解的功效,这在很大程度上推动了Aβ42聚集体的解聚。3.HS72与HT7对Aβ42O的结合力均为nM级水平,但与HS72与Aβ42O的亲和力略低于HT7。3D结构模拟与分子对接揭示了HS72分子中Asp45、His241和Ser150残基组成了催化三联体,该部位可与Aβ42O通过诱导契合的机理结合,从而实现HS72催化Aβ42O中靶Aβ42链的His 13-His 14肽键的水解断裂。由此揭示的HS72对Aβ42O的催化机理也说明了 HS72与Aβ42O的亲和力略低于HT7的必要性。上述结果与酶的催化理论相符,同时也确定了HS72具有丝氨酸蛋白酶的催化机制。4.在体外,HS72对SH-SY5Y和HT22两种神经细胞的形态和活力均表现出显著的保护功效,而且明显高于HT7的功效。这应该缘于HS72对毒性Aβ42聚集体的降解和抑制聚集/诱导解聚的多重功效,从而明显降低了Aβ42聚集体的神经毒性。Aβ42O的降解产物以及解离出的Aβ42M的安全性在此也得到了很好的验证。在体内,AD模型鼠经连续7天静脉注射HS72或HT7(每天一次)后,通过苏木精-伊红染色法(HE)和免疫组化(IHC)分析证明,两组中脑神经细胞的形态均得到了不同程度的改善,同时HS72、HT7组中海马区β-淀粉样斑块面积分别降低了约27.4%和5.6%,提示在体内HS72/HT7通过与Aβ42聚集体的多重相互作用导致Aβ42聚集体的分解和清除,HS72给药组的结果明显优于HT7给药组。5.基于苦参碱(Mat)与Aβ42O之间存在着特定的相互作用,进一步研究了Mat对HS72催化的Aβ42聚集体降解的影响。酶的激活剂是一种能够促进酶催化反应的化合物或金属离子,它通过与酶分子结合,改变酶分子的构象,从而提高酶的催化活性。然而,这里的Mat并不直接作用于HS72,而是既能与Aβ42O结合,又可与HS72-Aβ42O复合物结合,而这两种结合作用是协同的而非拮抗的。Mat与Aβ42O和与HS72-Aβ42O的相互作用共同促进了HS72对Aβ42O的催化降解,因此Mat起的作用是具有协同性质的促进或激活作用。为了简便起见,以下均称Mat对HS72的催购买BYL719化活性的协同性促进或激活作用为协同作用。本部分的研究结果表明,虽然低浓度Mat(0.01-2.5 μM)对Aβ42的聚集和毒性无明显的抑制作用,但却对HS72的催化作用具有协同效应:Mat通过增强HS72催化基团的催化能力和促进降解产物(Aβ片段)的释放提高了HS72的转换数,从而提高了HS72的催化活性,并在体外(SH-SY5Y、HT22细胞)、体内(AD鼠)均提高了HS72的神经保护功效,但不影响HS72与Aβ42O的特异性、结合力与亲和性。6.鉴于生物体内天然存在着单域抗体,而其分子量更小使其更易穿过血脑屏障,本论文进一步分析了单链抗体HS72的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的性质与功能。结果表明,VH&VH或VH&VL与HS72相似,兼有催化和抗体的双重功效,而VL&VL只具有抗体功效,虽然他们的自由组合具有整合构象的多样性。构象分析证明,HS72中的催化基团Asp45和His241仍分别参与构建了 VH&VH或VH&VL中的催化部位。更重要的是,虽然VH&VH或VH&VL对体外神经细胞的保护作用略低于HS72,但在AD鼠中,它们的功效(使海马区β-淀粉样斑块面积降低了约28.9%)却与HS72持平或略优于HS72,这可能与单域抗体穿过血脑屏障的效bacteriophage genetics率高于单链抗体有关。综合以上的研究结果,本论文得出如下结论:(1)催化性抗Aβ42O单链抗体在清除Aβ42聚集体和改善AD脑组织病理学变化方面优于普通的单链抗体;(2)小分子天然产物如Mat通过协同作用在低浓度时便可提高催化性单链抗体的功效;(3)在体内,单域抗体对脑细胞的保护功效略高于相应的单链抗体。HS72等催化性抗体的相关研究将为AD的药理学研究提供一定的实验依据和理论指导。