背景:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,预后不良。其起源于肝细胞,占原发性肝癌的90%。根据2020年全球癌症发病率、死亡率和患病率(GLOBOCAN)统计,其已成为全球第六大常见癌症,也是癌症相关死亡的第三大常见原因,亚洲为高发地区。HCC预后不佳的原因是早期无症状,确诊较晚,且对常规化疗和放疗有明显的耐药性。在肝癌治疗方面,早期确诊并且肿瘤大小在5cm以内的情况下,肝移植和手术切除是肝细胞癌的主要治疗手段。然而,由于该病在早期大多无明显症状,大多数患者确诊时即已经处于中晚期。目前,中晚期肝细胞癌则采用射频消融(RFA)、肝动脉栓塞法(TACE)、化学治疗和免疫治疗,然而近些年来,治疗耐药性和肿瘤复发已经成为制约疗效的重要障碍。放疗(Radiotherapy,RT)广泛应用于HCC患者,但由于辐射抗性,其疗效也常常受到制约。最近,有报道表明,在几种肿瘤类型中,从有氧呼吸到糖酵解(依赖Warburg效应)的肿瘤代谢模式的转换促进了其辐射抗性。然而,在肝癌中,肿瘤代谢转换调节辐射敏感性的机制仍不完全清楚。虽然辐射抗性(指低辐射敏感性)与细胞高糖酵解水平有关,但肿瘤代谢与辐射敏感性之间的潜在作用机制,以及组织蛋白酶Cathepsin H(CTSH)在此过程其中发挥的作用仍不清楚。目的:本研究旨在通过荷瘤模型和肝癌细胞系,使用高通量分析手段如单细胞测序、转录组测序以及蛋白质谱分析和随后的生物信息学分析,观察CTSH对细胞代谢和辐射敏感性的影响以及其调控肿瘤代谢及细胞死亡的信号通路和相应靶点。进而明确CTSH对于肝癌代谢以及后续细胞死亡的调控机制,以及对辐射敏感性的影响。方法:(1)使用HPA数据库、TCGA数据库及TNMplot平台检测肝癌组织及其他组织中CTSH的表达情况及其对于肝癌预后的的影响;(2)选用人肝癌细胞MHCC97H、HepG2和Huh7为研究对象。人胚肾细胞293T为工程细胞;(3)采用基因工程方法构建CTSH敲低载体,并建立相应稳定的CTSH敲低的细胞模型;(4)使用X射线直线加速器(型号:X-RAD 320 ix,Precision X)对细胞及实验动物进行电离辐射(X线)处理,照射条件:电压:320 k V,电流12.5mA,靶皮距50 cm,剂量率3.0 Gy/min;(5)台盼蓝染色后以及Annexin V染色后采用流式细胞术检测细胞死亡;集落形成实验检测细胞辐Tamoxifen浓度射敏感性;DIOC6染色后流式细胞术检测细胞线粒体膜电位;(6)免疫荧光共定位实验检测各研究蛋白在细胞中的定位情况及其表达;(7)Western blot检测蛋白表达水平变化;(8)采用单细胞测序对荷瘤大鼠照射后肿瘤细胞转录组进行测序分析;(9)PCR array检测候选基因照射前后表达水平变化情况,转录组测序检测肝癌细胞敲低CTSH后下游m RNA水平变化情况;(10)蛋白质谱检测敲低CTSH后细胞蛋白水平变化情况(11)GO和KEGG富集分析确定各处理条件下的差异基因与生物过程或通路之间的联系,GSEA确定各处理条件下发生显著变化的生物过程或通路。结果:1大分割放疗抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡首先,我们模拟大分割放疗,使用X线加速器和伽马刀对肝脏原位肿瘤大鼠模型进行照射。剂量分组为0Gy对照组以及7Gy/9Gy×3次照射组。与对照组相比,照射治疗组(IR)的肿瘤生长受到明显抑制,当剂量增加到9 Gy×3次时,这种抑制作用更加明显。然后,为了进一步检测辐射诱导的肿瘤抑制机制,我们对肿瘤组织进行了单细胞测序。生物过程(BP)富集分析显示,辐射后上调的基因与细胞死亡,尤其是凋亡高度相关。此外,通过KEGG富集分析,我们发现凋亡和TNF等细胞死亡相关信号通路的功能与这些基因密切相关。免疫组织化学染色(IHC)显示照射后CaspaseATM/ATR抑制剂3和凋亡诱导因子(AIF)表达阳性,证实了凋亡的发生。2 CTSH参与调控肝癌细胞辐射敏感性由于人和大鼠模型的同源性差异,为验证上述发现在人肝癌细胞中是否成立,我们进行了台盼蓝染色后的流式细胞检测,以验证IR后细胞死亡的方式。我们将凋亡抑制剂、铁死亡抑制剂和自噬抑制剂预处理应用于HCC细胞,发现ZVAD(常用的凋亡抑制剂)预处理可逆转辐射诱导的细胞死亡。在ZVAD预处理后,IR诱导的MHCC97H细胞死亡水平显著降低,而在其他组中,这种抑制效果并不明显,这验证了我们前面动物实验中富集分析和免疫组化染色的发现。下一步,我们将从动物实验后的富集分析结果中筛选出与细胞死亡相关的基因,并对其进行排列。为了进一步验证这些基因是否在人HCC细胞中发生了变化,我们进行了PCR array检测,使用MHCC97H和HepG2细胞系作为研究对象,并重点关注这些基因的表达变化情况,根据中心法则,转录总是发生在翻译之前,我们在照射后1小时和6小时进行了检测,并将各基因的差异表达情况列出,以寻找与动物实验结果变化一致的基因。同时,结合这些变化基因与肿瘤和死亡通路的相关性,我们将主要关注范围缩小到CTSD,CTSH和FAS。然后,由于FAS在HCC细胞中蛋白表达丰度较低,以及CTSD在m RNA和蛋白水平表达的不一致,我们最终选择CTSH进行进一步研究。为了进一步了解CTSH对肝癌细胞辐射敏感性的影响,我们在HepG2细胞中建立了CTSH稳定敲低模型,并通过克隆形成实验检测细胞辐射敏感性。结果显示,CTSH敲低(KD)显著增加了HepG2细胞的辐射敏感性。而与HepG2相比,MHCC97H细胞表现出显著较高的辐射敏感性,电离后CTSH的蛋白表达水平在MHCC97-H细胞中明显低于HepG2细胞。以上结果表明,抑制CTSH增加肝癌细胞的辐射敏感性。3抑制CTSH可以抑制糖酵解并促进有氧呼吸,进而提高HepG2细胞辐射敏感性为了进一步了解CTSH如何调节HCC代谢和辐射敏感性,我们对CTSH敲低和空载体对照组细胞进行了蛋白质谱(MS)分析。质谱结果显示,CTSH敲低后,有360个蛋白表达上调,430个蛋白表达下调。进一步的富集分析显示,上调的蛋白主要定位于线粒体。此外,这些上调的蛋白与线粒体功能和有氧呼吸相关,而下调的蛋白则与生物合成和代谢过程相关。由于线粒体在代谢和凋亡中发挥重要作用,而肿瘤代谢模式的转变换对细胞命运至关重要,于是为了进一步明确CTSH是否通过调节代谢模式的转换来影响细胞命运。我们对质谱分析结果进行了GSEA分析,结果标明,在CTSH敲低后,糖酵解代谢受到抑制,而有氧呼吸得到促进,而增强的有氧呼吸又可以进一步加重细胞的氧化应激从而引发细胞死亡。在此过程中,糖酵解的关键蛋白(限速酶)如HK2、PFKL、PKM和LDHA均下调。此外,三羧酸循环(TCA)的关键因子,如CS、OGDH和IDH,以及氧化磷酸化(OXPHOS)的促进因子,如AIFM1和CYC1,均在蛋白水平发生上调。与此同时,线粒体丙酮酸载体MPC1增加,提示线粒体丙酮酸摄入的增加,而后者也是线粒体有氧呼吸过程的重要底物原料。线粒体对丙酮酸摄入的增加以及三羧酸循环和氧化磷酸化水平的增加,共同构成了有氧呼吸链信号通路的上调。考虑到已报道的糖酵解与辐射敏感性之间的关联,上述结果表明,抑制CTSH可以通过扰乱糖酵解并将肿瘤代谢模式逆转为以有氧呼吸为主,从而促进HepG2细胞的辐射敏感性。4增强的有氧呼吸与敲低CTSH后上调的AIF及IAP抑制因子共同促进辐射诱导的细胞凋亡越来越多的研究表明,通过抑制糖酵解和促进氧化磷酸化(OXPHOS,有氧呼吸链的一部分)可以限制肿瘤的发展。而已有报道上调的三羧酸循环和氧化磷酸化可以通过促进ROS的积累和氧化应激的发生,最终促进细胞凋亡。鉴于之前富集分析发现CTSH参与了细胞凋亡,我们进一步探究了CTSH调控凋亡的分子机制。对蛋白质谱结果的进一步GSEA分析显示,CTSH的下调的确促进了凋亡进程。为了证实这一点,我们非照射和照射条件下的空载体对照(sh Vector)以及CTSH敲低(sh CTSH)HepG2细胞模型进行了Annexin V-PI染色流式细胞术检测。结果表明,敲低CSTH可以促进凋亡,而电离辐射进一步促进了凋亡的发生。结合我们之前的结果以及AIFM1(凋亡诱导因子,线粒体型)的上调,我们接下来探讨了敲低CTSH在促凋亡过程中涉及到的详细机制。从GSEA分析结果中,我们发现许多凋亡相关蛋白的表达在CTSH敲低后受到影响。因此,为了找出CTSH通过线粒体通路调节凋亡的靶点,我们将富集分析后凋亡相关和线粒体相关基因取交集,得到了14个基因的基因集,其中9个上调,5个下调。其中,HTRA2和DIABLO发生上调,且二者均被报道作为凋亡抑制因子(IAP)家族的抑制剂促进凋亡的发生。免疫荧光共定位实验进一步验证了我们的发现,与空白转染+非照射组(Sh Vec+NC)相比,CTSH敲低+非照射组(sh CTSH+NC)的HTRA2和DIABLO发生了显著上调,并可在电离辐射后(sh CTSH+IR组)抑制细胞中IAP家族蛋白(XIAP和Survivin)的抗凋亡作用,且二者对IAP家族蛋白的抑制性结合分别发生在细胞核及胞核周围的细胞质内。作为一种杀伤蛋白,上调的AIFM1除了促进氧化磷酸化过程外,还在凋亡过程中发挥诱导DNA断裂的功能,又由于已知被促进的有氧呼吸中的氧化磷酸化可以进而促进凋亡,综合考虑,以上结果揭示了一种基于上调有氧呼吸的促凋亡效应的机制。此外,caspase家族(Caspase9和Caspase3)表达的增加(活化)最终证实了这些联系。从这些结果中,我们推断,对于凋亡的促进作用,是通过增强的有氧呼吸,以及敲低CTSH后上调AIF及IAP抑制因子共同实现的,5抑制CTSH可通过改变线粒体膜通透性和稳定性来促进促凋亡因子的释放细胞凋亡包括内源性(受线粒体调控)和外源性(死亡受体介导)机制。正如之前的结果所提示的,线粒体相关基因参与了凋亡,所以我们进一步将接研究重点聚焦在线粒体功能的变化和凋亡之间的关系上。值得注意的是,GSEA结果显示,敲低CTSH后,线粒体跨膜转运和线粒体内容物(如细胞色素c)释放的信号通路发生上调。其中,VDAC家族的功能是通过在线粒体外膜形成通道,允许亲水分子的扩散。它在低膜电位或零膜电位下开放,在30-40 m V以上的电位下关闭。我们发现VDAC1/2/3蛋白在敲低CTSH后发生上调,提示了潜在的膜通透性增加,而随后的线粒体膜电位(MMP)的流式细胞术检测进一步证实了这种变化:辐射可以使膜电位发生降低,而敲低CTSH并未显著降低线粒体膜电位,提示电离辐射可以与CTSH敲低发挥协同作用,降低线粒体膜通透性,进而促进凋亡相关因子的释放。敲低CTSH后发生变化的蛋白中Fam162A、FIS1和OPA1等也被报道参与促凋亡因子释放(如细胞色素c)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活(如CASP9)和线粒体通透性转变诱导,在CTSH敲低后,所有这些基因都被上调。除了在糖酵解中的Drug Screening作用,HK2还发挥着维持线粒体外膜完整性和稳定性的作用,阻止凋亡分子从膜间隙释放和随后的凋亡。它结合并抑制VDAC以抑制线粒体功能,同时刺激糖酵解。敲低CTSH后,HK2也被观察到了蛋白水平的下调,同样提示了以上情况的发生。以上结果表明,敲低CTSH可以增加线粒体膜的通透性和不稳定性,辐射诱导的线粒体膜电位(MMP)降低可激活CTSH敲低带来的潜在的线粒体膜通透性的增加,CTSH敲低导致的膜稳定性降低使照射后分子更容易从线粒体释放,从而促进凋亡过程。这为凋亡的增加的机制提供了一种较为完整的解释:CTSH敲低通过调节线粒体膜的通透性和稳定性,促进了辐射后促凋亡蛋白的释放。6 CTSH及其下游靶蛋白与肿瘤的发生和不良预后密切相关,且具有一定普适性随后,为了验证CTSH在临床应用中的潜力,我们选用几家广泛公认的数据库,进行了一系列的生物信息学分析。m RNA水平上,CTSH在HCC中的表达显著高于非肿瘤样本(来源于GEPIA)。此外,在对一个由370例HCC患者组成的临床队列进行的分析中,较高的CTSH表达与不良预后(较低的生存率)显著相关(来源于Kaplan-Meierplotter)。另一个对365例患者进行的KaplanMeier(KM)生存分析显示,蛋白水平上,CTSH的表达同样与较差的患者生存显著相关。CTSH的下游靶蛋白(特别是糖酵解相关基因)的多基因表达分析显示,和单独观察CTSH时的情况类似,他们与肿瘤发生发展显著相关(来自TNMplot)。此外,通过联合CTSH及其下游靶基因表达(即CTSH高表达联合PFKL、PKM、LDHA、HK2高表达;以及IDH、MPC1、AIFM1和HTRA2低表达联合高CTSH表达),我们发现CTSH联合其下游糖酵解相关蛋白与肝癌的不良预后具有显著相关性(Kaplan-Meier绘图仪)。然后,为了验证上述结果的普适性,我们先使用两个不同的数据库绘制了CTSH表达谱(TNMplot和GEPIA),并综合选出了几个CTSH同样异常高表达的肿瘤。值得注意的是,CTSH与所有这几种肿瘤的不良预后相关。此外,KM生存分析显示,CTSH在其高表达的恶性肿瘤中(如宫颈鳞状细胞癌、食管癌和胰腺腺癌),与不良预后之间存在显著相关性(Kaplan-Meier绘图仪)。然而,在其他低恶行度或CTSH未存在异常高表达的肿瘤中,这一关系似乎不显著,甚至相反。综上所述,这些发现提示了CTSH联合其下游蛋白的临床治疗和诊断价值。结论:1.大分割放射治疗抑制了肿瘤生长,诱导其发生凋亡,且这一现象在人类肝癌细胞中得到验证,但不同细胞间的辐射敏感性却存在差异,CTSH在这一过程中发挥了重要作用。2.抑制CTSH可以干扰肿瘤依赖的有氧糖酵解及其下游代谢过程,同时促进其能量代谢方式向依赖有氧呼吸方向转变。3.增强的有氧呼吸可通过增加下游产物从而加重细胞氧化应激水平促进凋亡,同时有氧呼吸链中AIF的上调以及上调的HTRA2和DIABLO可以通过Caspase非依赖性和依赖性(对IAP蛋白家族的抑制作用)两种线粒体调控途径促进凋亡的发生。4.对凋亡过程的促进,是通过增加线粒体膜通透性以及破坏其结构稳定性后,与电离辐射协同作用促进相关因子释放的结果。5.CTSH与其下游调控的因子联合作用,可对肝癌的诊断与治疗提供潜在应用价值。