研究背景与目的:急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)是多种因素引起短时间内发生肝细胞大量死亡及肝脏功能急剧恶化,并引起肝性脑病的一组严重临床综合征。目前ALF的发病机制尚未完全明确,近年来学者多倾向于“三重打击”与“时相”学说,即免疫损伤、缺血缺氧性损伤和内毒素血症的“三重打击”,导致肝细胞死亡;上升前期以免疫损伤为主、上升期三重打击均参与、平台期以内毒素损伤为主。ALF进展迅速,死亡率高,目前治疗仍无突破性进展,西医用来治疗ALF的主要方法是肝移植,因供体缺乏、费用昂贵、免疫排斥以及长期免疫抑制剂的使用等因素而无法广泛应用。寻找有效的治疗方法对ALF患者具有重要意义。铁死亡(Ferroptosis)是一种新型的细胞死亡形式,在细胞形态和功能上与坏死、凋亡、自噬等程序性死亡不同,具有铁依赖性,其特征是脂质过氧化的积累。在形态学上,铁死亡主要发生在细胞中,表现为线粒体体积减少、双层膜密度增加以及线粒体嵴减少或消失,但细胞膜保持完整,细胞核大小正常。生化上,细胞内谷氨酸/胱氨酸逆向转运系统(Xc-系统)受到抑制,谷胱甘肽(GSH)耗竭,谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)活性降低,导致脂质ROS大量生成,促进铁死亡。铁代谢失调与多种肝病的发展有关,阐明ALF中肝细胞铁死亡调控机制有望为ALF的救治提供新的策略。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)是脂多糖(LLY294002核磁PS)受体,介导炎症反应,导致组织损伤和疾病。核因子E2相关因子2(Nuclear factor red related factor2,Nrf2)是抗氧化应激转录因子,在铁死亡调节中起关键作用。TLR4信号和Nrf2信号被广泛认为是治疗肝疾病的潜在靶标。扁蓄苷(Avicularin,AL),又称槲皮素-3-α-L-阿拉伯呋喃糖苷,是一种黄酮类化合物,功效广泛的中药单体,具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗抑郁和保护肝脏等多种药理作用。然而,AL的抗急性肝衰竭作用及分子机制尚不清楚。本研究将进一步探讨ALF发生发展的分子机制并考察AL对ALF小鼠炎症和铁死亡的影响,从而为ALF多靶点联合治疗及多靶点药物开发提供新的理论依据。材料与方法:(一)AL对LPS/D-GalN诱导的ALF小鼠的保护作用1.C57BL/6J小鼠随机分为3组:Control组、ALF模型组和AL组。Control组小鼠腹腔注射生理盐水对照处理;ALF模型组小鼠腹腔注射LPS/D-GalN造模;AL组小鼠连续灌胃给药7 d,处死前30min腹腔注射LPS/D-GalN。2.检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平,评价肝功能情况。3.HE染色观察肝组织病理学变化。4.检测血清、肝脏炎症水平:IL-6、IL-1β、TNF-α、i NOS和COX-2。5.检测肝脏铁死亡相关表型的变化:MDA、GSH、ROS和Fe~(2+)含量。(二)AL抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路拮抗LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症1.LPS诱导小鼠RAW 264.7巨噬细胞激活:通过LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞炎症模型观察巨噬细胞激活相关指标,如IL-6、TNF-α、i NOS和COX-2等。2.AL对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞激活的影响:采用RT-q PCR、Western blot和细胞免疫荧光技术检测巨噬细胞激活相关指标,如IL-6、TNF-α、i NOS和COX-2等。3.采用计算机分子对接技术,评价TLR4蛋白与AL之间的相互作用。4.AL抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路拮抗LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症:Western blot检测巨噬细胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白的表达,以评估巨噬细胞激活中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白的表达情况及AL对TLR4、MyD88和NF-κB的影响。进一步使用TLR4的特异性抑制剂(TAK-242)、NF-κB的特异性抑制剂(PDTC)对巨噬细胞中TLR4/MyD88/NF-κB通路进行阻断,LPS刺激细胞,根据实验目的进行分组。Western blot检测巨噬细胞激活相关指标,细胞免疫荧光技术检测NF-κB p65的易位,以评估TLR4/MyD88/NF-κB在巨噬细胞激活中的重要作用及AL是否通过TLR4/MyD88/NF-κB通路调控巨噬细胞激活。(三)AL激活Nrf2/HO-1/GPX4通路抑制D-GalN诱导的HepG2细胞铁死亡1.D-GalN诱导HepG2细胞损伤:通过CCK-8实验检测D-GalN刺激HepG2细胞的细胞活性,以造成体外肝细胞损伤模型。2.AL对D-GalN诱导的HepG2细胞活力的影响:CCK-8实验检测AL对D-GalN诱导的HepG2细胞活力的影响。3.AL对D-GalN诱导的HepG2细胞铁死亡的影响:通过D-GalN诱导HepG2细胞损伤模型观察铁死亡相关表型的变化,如透射电镜观察损伤细胞超微结构变化,检测细胞线粒体膜电位(MMP)、谷胱甘肽(GSH)含量、丙二醛(MDA)含量、活性氧(ROS)水平和Fe~(2+)水平,通过Western blot检测铁死亡相关蛋白GPX4、x CT/SLC7A11的表达。4.采用计算机分子对接技术,评价Nrf2蛋白与AL之间的相互作用。5.AL通过激活Nrf2/HO-1/GPX4通路抑制D-GalN诱导的HepG2细胞铁死亡:Western blot检测HepG2细胞中Nrf2、HO-1、GPX4和x CT/SLC7A11蛋白的表达,以评估肝细胞铁死亡中Nrf2、HO-1、GPX4、x CT/SLC7A11蛋白的表达情况及AL对Nrf2、HO-1、GPX4、x CT/SLC7A11的影响。进一步使用Nrf2的特异性抑制剂(ML385)对HepG2细胞中Nrf2/HO-1/GPX4通路进行阻断,D-GalN刺激细胞,根据实验目的进行分组。Western blot检测铁死亡关键分子,以评估Nrf2/HO-1/GPX4在肝细胞铁死亡中的重要作用及AL是否通过Nrf2/HO-1/GPX4通路调控肝细胞铁死亡。(四)AL体内调控TLR4与Nrf2信号通路抑制炎症与铁死亡对小鼠急性肝衰竭的影响1.C57BL/6J小鼠随机分为7组:Control组、ALF模型组、AL组、TAK-242组、AL+TAK-242组、ML385组、AL+ML385组。Control组小鼠腹腔注射等量生理盐水;ALF模型组小鼠腹腔注射LPS/D-GalN;AL组小鼠连续AL灌胃7天,治疗结束30min内腹腔注射LPS/D-GalN;TAK-242组小鼠连续腹腔注射TAK-242(3mg/kg)2天,治疗结束30min内腹腔注射LPS/D-GalN;AL+TAK-242组小鼠连续AL灌胃7天,同时腹腔注射TAK-242(3mg/kg)2天,治疗结束30min内腹腔注射LPS/D-GalN;ML385组小鼠连续腹腔注射ML385(30 mg/kg)7天,治疗结束30min内腹腔注射LPS/D-GalN;AL+ML385组小鼠同时AL灌胃和ML385(30 mg/kg)腹腔注射7天,治疗结束30min内腹腔注射LPS/D-GalN。2.检测血清ALT和AST水平,评价肝功能情况。3.HE染色观察肝组织病理学变化。4.ELISA检测血清IL-6、IL-1β、TNF-α浓度。5.检测肝脏铁死亡相关表型的变化:MDA、GSH、ROS和Fe~(2+)含量。结果:(一)AL对LPS/D-GalN诱导的ALF小鼠的保护作用1.LPS/D-GalN成功诱导ALF小鼠模型:10μg/kg LPS联合800mg/kg D-GalN腹腔注射5h诱导小鼠典型肝衰竭表现,HE染色示肝细胞结构排列紊乱,出现广泛的细胞水肿和气球样变;肝小叶内出现点状或片状坏死;肝小叶内与汇管区可见炎性细胞浸润。血清ALT和AST水平显著升高(P<0.01)。2.AL减轻LPS/D-GalN诱导的小鼠肝脏病理和肝细胞功能损伤:与ALF模型组相比,AL组小鼠肝组织淤血坏死及炎性细胞浸润减轻,血清ALT和AST水平显著下降(P<0.05)。3.AL抑制LPS/D-GalN诱导的小鼠体内炎症:与ALF模型组相比,AL组小鼠肝脏IL-6、IL-1β、TNF-α、i NOS和COX-2基因及蛋白表达显著降低(P<0.05),血清Iselleckchem KD025L-6、IL-1β、TNF-α浓度显著降低(P<0.05)。4.AL抑制LPS/D-GalN诱导的小鼠肝脏发生铁死亡:与ALF模型组相比,AL组小鼠肝脏GSH含量升高,MDA、ROS和Fe~(2+)水平降低(P<0.01)。(二)AL抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路拮抗LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症1.LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞激活:1μg/m L LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞24h可诱导巨噬细胞激活。2.AL抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞激活:与LPS模型组相比,AL组巨噬细胞激活相关指标,如IL-6、TNF-α、i NOS和COX-2表达水平明显下降(P<0.05)Bioactive hydrogel。3.TLR4与AL的分子对接评分为-6.5 kcal/mol,表明TLR4与AL空间结合力较好。4.AL抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路拮抗LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症:与未处理的细胞相比,LPS处理的巨噬细胞中TLR4、MyD88、磷酸化IκBα和磷酸化p65蛋白表达显著增加。而AL呈剂量依赖性降低这些蛋白表达(P<0.05)。使用TAK-242(TLR4抑制剂)和PDTC(NF-κB抑制剂)处理巨噬细胞。与TAK-242或AL单独处理相比,TAK-242和AL联合处理对TLR4和MyD88的蛋白表达有更强的抑制作用(P<0.05)。同样,与PDTC或AL单独处理相比,PDTC和AL联合处理更能抑制IκBα、p65的磷酸化水平、以及下游炎症介质i NOS和COX-2的表达(P<0.05)。细胞免疫荧光实验显示PDTC和AL共同处理显著抑制了LPS诱导的RAW 264.7细胞p65核移位。(三)AL激活Nrf2/HO-1/GPX4通路抑制D-GalN诱导的HepG2细胞铁死亡1.D-GalN诱导HepG2细胞损伤:50 m M D-GalN处理HepG2细胞6h可造成细胞损伤模型。2.AL减轻D-GalN诱导的HepG2细胞活力下降:AL(10、20、40μM)呈剂量依赖性减轻D-GalN对HepG2细胞的毒性作用(P<0.05)。3.AL抑制D-GalN诱导的HepG2细胞铁死亡:透射电镜下D-GalN诱导HepG2细胞呈现典型的铁死亡特征:线粒体明显缩小,膜密度增高,嵴减少,细胞核中形态变化不明显;D-GalN诱导HepG2细胞线粒体膜电位下降(P<0.01)、MDA含量升高(P<0.01)、GSH含量下降(P<0.01)、ROS水平升高(P<0.05)、胞内Fe~(2+)含量显著升高(P<0.05),GPX4、x CT/SLC7A11蛋白表达显著下降(P<0.01)。然而,AL和铁死亡抑制剂Fer-1逆转了这些改变(P<0.05)。4.Nrf2与AL的分子对接评分为-5.7 kcal/mol,表明Nrf2与AL空间结合力较好。5.AL通过激活Nrf2/HO-1/GPX4通路抑制D-GalN诱导的HepG2细胞铁死亡:与未处理的细胞相比,D-GalN诱导的HepG2细胞中Nrf2、HO-1、GPX4和x CT/SLC7A11蛋白表达明显降低,而AL处理明显上调这些蛋白表达(P<0.05)。相反,Nrf2特异性抑制剂ML385显著消除了AL对D-GalN诱导HepG2细胞中Nrf2、HO-1、GPX4和x CT/SLC7A11蛋白表达的恢复(P<0.01)。(四)AL体内调控TLR4与Nrf2信号通路抑制炎症与铁死亡对小鼠急性肝衰竭的影响1.AL通过抑制TLR4信号通路、激活Nrf2信号通路改善小鼠急性肝衰竭:与ALF模型组相比,TAK-242组HE染色示肝脏淤血坏死明显减轻,血清ALT和AST水平明显下降(P<0.01)。相反,ML385组比ALF模型组表现出更严重的肝损伤(肝细胞坏死、小叶结构破坏、炎症细胞浸润、明显血管充血和出血)和更高的血清ALT、AST水平(P<0.05)。与TAK-242组相比,AL+TAK-242组肝脏病理学变化一致,血清ALT和AST水平明显下降(P<0.01)。与ML385组相比,AL+ML385组肝脏淤血坏死减轻,血清ALT和AST水平明显下降(P<0.05)。此外,与ALF模型相比,AL组肝脏病理及肝功能损伤明显减轻(P<0.01)。2.AL主要通过抑制TLR4信号通路减轻急性肝衰竭小鼠炎症反应:与ALF模型组相比,TAK-242组血清TNF-α、IL-1β、IL-6浓度明显下调(P<0.01);相反,ML385组血清炎症因子无明显变化(P>0.05)。与TAK-242组相比,AL+TAK-242组血清炎症因子进一步下调(P<0.05)。与ML385组相比,AL+ML385组血清炎症因子水平明显降低(P<0.05)。此外,与ALF模型相比,AL组炎症水平明显下降(P<0.05)。3.AL主要通过激活Nrf2信号通路减轻急性肝衰竭小鼠肝脏铁死亡:与ALF模型相比,AL组肝脏GSH水平升高(P<0.05),MDA、Fe~(2+)和ROS水平降低(P<0.01),免疫组化法检测GPX4的表达水平上调(P<0.01),表明AL可以减轻急性肝衰竭小鼠肝脏中的铁死亡。进一步分析发现,与AL组相比,AL+TAK-242组上述指标变化无明显差异(P>0.05);而AL+ML385组铁死亡加重(P<0.05)。此外,与ALF模型组相比,ML385组肝脏铁死亡明显加重(P<0.05);而TAK-242组上述指标无明显改变(P>0.05)。结论:1.AL给药能够改善LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝衰竭模型的肝脏损伤,抑制炎症反应,降低肝脏中的铁死亡病变,从而发挥保肝作用。2.AL通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减轻巨噬细胞的活化,降低炎症反应;AL通过激活Nrf2/HO-1/GPX4信号通路而减轻肝细胞中的铁死亡,发挥对肝细胞的保护作用。3.分子对接研究表明,TLR4和Nrf2蛋白与AL均有较好的结合,可能是AL的直接靶点。进一步提示,AL可能靶向TLR4和Nrf2蛋白而调节双通路而发挥急性肝衰竭的保护作用。