背景及目的骨缺损的修复是目前临床医生面临的巨大挑战之一,理想的骨缺损修复离不开炎症的控制。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)已被报道具有良好的炎症调节能力并广泛用于组织再生工程(Tissue regeneration engineering,TRE)中。基于MSCs来源的细胞聚集(Cell aggregates)与细胞膜片(Cell sheet,CS)已应用于心脏、角膜、食管、牙周、软骨及骨等临床领域,其机制很大程度归功于保留的细胞外基质、内含的丰富细胞因子、生长因子及蛋白质等与宿主损伤部位分子间的相互作用。然而,由于异体干细胞治疗移植过程中存在一定免疫原性,通过获取MSCs上清液来源的分泌物(Exudates)、外泌体(Exosomes,Exo)及细胞外囊泡等作为无细胞治疗策略在TRE中越发受到关注,它可以通过旁分泌途径传递细胞间的信息,参与宿主免疫调节从而促进组织的再生与修复。在骨组织工程(Bone tissue engineering,BTE)中,相较于骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与牙髓干细胞(Dental pulp stem cells,DPSCs),乳牙牙髓干细胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHEDs)具有更高的增殖、成骨分化潜能、低免疫原性等优势,在经成骨诱导形成细胞膜片后,其细胞外分泌物中含有更丰富的成骨及免疫调节等相关因子。乳牙牙髓干细胞膜片上清液(SHEDs sheet-derived Exudates,SS-E)作为一种无细胞提取物与巨噬细胞交互作用及成骨能力尚未被报道。因此本研究拟收取成骨诱导后的SS-E,将其作用于M1型促炎型巨噬细胞,探索其炎症调节能力,随后收取上清液配置条件培养基,模拟炎症微环境,通过体外实验验证SS-E对BMSCs成骨能力的影响,继而在大鼠下颌骨处建立缺损模型,经动物体内验证SS-E联合Gel-MA凝胶支架对大鼠下颌骨缺损处成骨作用的影响,进一步通过转录组学验证SS-E抑制M1巨噬细胞的炎症过程中mRNA的差异表达,为骨组织再生工程应用细胞膜片上清液作为无细胞治疗策略提供一定的理论依据。材料与方法第一部分:成骨诱导的SHEDs膜片上清液经巨噬细胞特异性免疫调节对骨髓间充质干细胞成骨作用的体外研究收集P2 SHEDs,通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测SHEDs的表面标记物。利用成骨培养液(Osteogenic mineralization solution,OM)诱导 SHEDs形成细胞膜片(SHEDs sheets,SS),随后收集上清液,通过高速离心法浓缩上清液获得 SS 上清液(SHEDs sheets-derived Exudates,SS-E),通过 BCA 检测试剂盒测定SS-E的蛋白浓度,确定初始浓度后,用无菌PBS缓冲液配置成相应浓度用于后续实验。配置含浓度为0、0.8、1.6、3.2 mg/mL SS-E的增殖培养基,通过细胞活性测定法(Cell counting kit-8,CCK-8)探索其对RAW 264.7细胞的增殖作用。利用100 ng/mL脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导M1型巨噬细胞形成,将含0、0.8、1.6、3.2 mg/mL SS-E的DMEM培养基作用于M1型巨噬细胞,实时荧光定量 PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测炎症相关基因 iNOS、ARG-1、IL-10的表达量。筛选出SS-E最佳浓度后,配置含浓度为0、1.6 mg/mL SS-E的DMEM培养基,作用于M1型巨噬细胞,蛋白印迹法(Western blot,WB)检测iNOS、ARG-1的蛋白表达量,FCM检测CD206的蛋白表达量。经SS-E调节M1型巨噬细胞后提取的上清液,配置条件培养基(SS-E-CM组),对照组为未经PF-07321332采购SS-E处理的M1型巨噬细胞的上清液(CM组)及单纯的OM培养基(OM组),通过CCK-8探索其对BMSCs增殖能力的影响,qRT-PCR法检测ALP、BMP-2、RUNX-2的成骨相关基因表达量,WB检测ALP、BMP-2、RUNX-2的成骨相关蛋白表达量,ALP染色法、茜素红染色法及氯化十六烷基吡啶(Cetylpyridine chloride,CPC)半定量法分析其对BMSCs矿化能力的影响。第二部分:成骨诱导的SHEDs膜片上清液联合凝胶支架对骨缺损修复的体内研究选择SPF级SD大鼠(n=12),于双侧下颌骨磨牙区分别制备体积为3×3×3mm的颌骨缺损模型,实验组为含浓度为1.6mg/mL SS-E的Gel-MA凝胶,对照组为含等体积PBS的Gel-MA凝胶,植入缺损处,覆盖生物膜,后续每周2次局部给药,实验组注射200 μL浓度为1.6 mg/mL的SS-E,对照组注射等体积的无菌PBS,连续给药2周。术后6周时,将大鼠处死后取其完整下颌骨,进行Micro-CT扫描,随后进行H&E及Masson染色分析其骨再生情况,以及免疫组化分析其炎症、成血管及成骨相关因子的表达结果。第三部分:成骨诱导的SHEDs膜片上清液对巨噬细胞特异性免疫调节的转录组学研究先用100 ng/mL LPS诱导M0型巨噬细胞转变为M1型巨噬细胞,使用1.6 mg/mL SS-E处理M1型巨噬细胞24 h后收集上清液(LAlpelisibPS+SS-E组,n=3),对照组为未经SS-E处理的M1型巨噬细胞的上清液(LPS组,n=3),进行高通量测序,构建mRNA的表达谱,设定|logFC|>1、P<0.05列出mRNA的差异表达基因(Differentially expressed genes,DGEs),对 DGEs 的宿immune-based therapy主基因进行 KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析及 GSEA(Gene Set Eenrichment Analysis)分析。结果第—部分:成骨诱导的SHEDs膜片上清液经巨噬细胞特异性免疫调节对骨髓间充质干细胞成骨作用的体外研究1.本实验证实了从乳牙中成功提取出的细胞为MSCs来源;2.SS-E对RAW 264.7细胞的增殖具有促进作用,其中浓度1.6 mg/mL促进效果较佳;3.SS-E促进M1型巨噬细胞的抑炎型基因ARG-1、IL-10表达(P<0.05),抑制其促炎相关基因iNOS表达(P<0.05),浓度1.6 mg/mL的抑炎作用较佳;4.1.6 mg/mL SS-E上调M1型巨噬细胞的抑炎相关蛋白ARG-1表达(P<0.05)和表面蛋白CD206的表达,下调促炎相关蛋白iNOS的表达(P<0.05);5.本实验证实了从鼠胫骨提取的MSCs为BMSCs;6.SS-E-CM对BMSCs细胞增殖具有一定促进作用;7.SS-E-CM上调BMSCs成骨相关标记物ALP、BMP-2、RUNX-2的基因和蛋白表达水平(P<0.05),促进ALP活性及成骨矿化结节的产生(P<0.05)。第二部分:成骨诱导的SHEDs膜片上清液联合凝胶支架对骨缺损修复的体内研究1.Micro-CT结果显示SS-E+Gel-MA组下颌骨缺损处的骨组织再生程度高于对照组,其相关骨生成相关指数BV/TV和BS/TV均高于对照组(P<0.05);2.H&E及Massom染色结果显示相对于对照组,SS-E+Gel-MA组新生骨组织生成量及新生血管更多,定量结果与定性结果一致(P<0.05);3.免疫组化结果显示SS-E+Gel-MA组的iNOS染色程度低于对照组,ARG-1、CD31、OCN染色较对照组深。第三部分:成骨诱导的SHEDs膜片上清液对巨噬细胞特异性免疫调节的转录组学研究1.本实验通过高通量转录组学测序技术,构建了 SS-E对巨噬细胞的抑炎过程中的mRNA表达谱,结果显示了共有661个差异基因上调,520个差异基因下调;2.差异表达的mRNA主要参与TNF及JAK-STAT信号通路等多个与炎症反应相关的生物学过程。结论成骨诱导的SHEDs膜片上清液(SS-E)在体内外均具有抑制炎症及促进骨组织再生的作用。SS-E抑制M1型巨噬细胞及促进M2型巨噬细胞的相关基因及蛋白分泌,通过炎症调节促进BMSCs的成骨分化过程,结合生性分析,同时引起了一系列基因及蛋白的差异性表达。