[背景与目的]冠状动脉粥样硬化血栓形成是导致急性心肌梗死(AMI)的主要原因,但其机制尚未完全阐明。本研究拟通过检测不同临床类型冠状动脉粥样硬化患者,尤其是AMI患者血浆杀菌/通透性增加蛋白(BPI)、S100钙结合蛋白A8/A9复合物(S100A8/A9)和髓过氧化物酶-DNA复合物(MPO-DNA)表达水平,分析AMI患者血浆BPI的差异表达与NETosis(中性粒细胞的炎性细胞死亡方式)的关联性,并在体外和体内实验中进一步阐明BPI通过活化血小板,增强中性粒细胞NETosis,促进冠状动脉粥样硬化血栓形成的机制。第一部分急性心肌梗死患者血浆BPI的差异表达及其与NETosis的关联性分析[材料与方法]1.前瞻性连续筛查2020年5月1日至8月31日在我院接受冠状动脉造影检查和/或经皮冠状动脉介入治疗的患者,纳入不同临床类型冠状动脉粥样硬化患者:ST段抬高型心肌梗死(STEMI)、非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)、不稳定型心绞痛(UAP)、单纯冠状动脉粥样硬化(CAS),以及正常对照组(Control)。2.分别在入院后30分钟内和出院时采集血液样本,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定高敏 C 反应蛋白(hs-CRP)、白介素 1 β(IL-1 β)、MPO-DNA 和 S1OOA8/A9表达水平。3.比较 AMI 组(STEMI/NSTEMI)和对照组血浆 BPI 与 hs-CRP、IL-1β、MPO-DNA、S100A8/A9表达水平。Gensini评分系统评估冠状动脉粥样硬化病变严重程度。分别采用Spearman’s相关性分析和一元线性回归分析检验AMI患者血浆BPI表达水平与外周血中性粒细胞计数和血小板计数、以及血浆hs-CRP、IL-1β、MPO-DNA、S100A8/A9表达水平和Gensini评分的相关性。受试者工作特征曲线(ROC)分析血浆BPI对AMI的诊断效能。4.进一步检测不同临床类型冠状动脉粥样硬化患者血浆BPI与hs-CRP、IL-1β、MPO-DNA、S100A8/A9表达水平,分别采用Spearman’s相关性分析和一元线性回归分析检验血浆BPI表达水平与hs-CRP、IL-1β、MPO-DNA、S100A8/A9表达水平、以及与Gensini评分的相关性。定义主要不良心血管事件(MACEs),包括再发心肌梗死,再发心绞痛,缺血性卒中,心力衰竭住院和死亡。随访所有冠状动脉粥样硬化患者,包括STEMI、NSTEMI、UAP和CAS。Cox 比例风险回归模型分析血浆BPI表达水平和MACEs事件的关系。依据血浆BPI浓度中位值将冠状动脉粥样硬化患者分成两组:高BPI组和低BPI组,比较两组活化部分凝血活酶时间、国际标准化比值、Fibrinogen和D-dimer水平,比较两组MACEs事件发生率的差异,Log-rank检验比较两组无MACEs事件Kaplan-Meier生存曲线的差异。[结果]1.本研究最终纳入AMI 122例,UAP 134例,CAS 64例和Control 80例;AMI又分为STEMI 59例和NSTEMI 63例。AMI组患者血浆BPI表达水平显更多著高于正常对照组[50.83(38.53,62.33)ng/mL vs 5.45(3.62,7.65)ng/mL,P<0.001]。在 AMI 组中,进一步发现STEMI组血浆BPI水平显著高于NSTEMI组(P<0.001)。AMI患者外周血中性粒细胞计数与血浆BPI水平呈正相关(rs=0.500,P<0.004),而外周血血小板计数与血浆BPI水平的相关性无统计学意义(rs=0.094,P=0.191)。AMI组血浆BPI与 hs-CRP、IL-1β、MPO-DNA、S100A8/A9 表达水平呈正相关(rs=0.834,P<0.001;rs=0.783,P<0.001;rs=0.740,P<0.001;rs=0.679,P<0.001),与 Gensini 评分呈正相关(rs=0.791,P<0.001)。2.受试者工作特征曲线分析显示血浆BPI诊断AMI的最佳截断值为35.17 ng/mL。血浆BPI与心肌坏死标志物CK-MB和TnI诊断AMI的ROC曲线下面积(Area under the ROC curve,AUC)分别为 0.938(0.893～0.983)、0.709(0.610～0.807)、0.824(0.747～0.901)。Z检验表明,血浆BPI与CK-MB对AMI诊断效能的差异有统计学意义(BPI vs CK-MB:Z=3.673,P=0.0001)。3.不同临床类型冠状动脉粥样硬化患者血浆BPI与hs-CRP、IL-1β、MPO-DNA、S100A8/A9表达水平均显著升高。并且冠状动脉粥样硬化患者血浆BPI与hs-CRP、IL-1β、MPO-DNA、S100A8/A9表达水平呈正相关,与Gensini评分呈正相关性。4.依据血浆BPI浓度的中位值41.10 ng/mL,将冠状动脉粥样硬化患者分为高BPI组(BPI>41.10ng/mL)和低 BPI 组(BPI ≤41.10 ng/mL)。与低 BPI 组比较,高BPI组活化部分凝血活酶时间缩短,国际标准化比值降低;同时,Fibrinogen和D-dimer水平显著升高(allP<0.05)。平均随访22.18个月,62人发生MACEs事件(62/320,19.38%),其中高 BPI 组 42 人发生(42/160,26.25%),低 BPI 组 20 人发生(20/160,12.5%)。高 BPI 组 MACEs 事件发生率显著高于低 BPI 组(Log-rank test χ2=7.803,P=0.021)。Cox分析表明BPI是预测冠状动脉粥样硬化患者MACEs事件发生的独立危险因素。第二部分BPI活化血小板增强中性粒细胞NETosis[材料与方法]1.随机抽取AMI患者和正常对照组静脉血30 mL各15例,制备人富含血小板血浆(PRP)。以anti-CD41-FITC和anti-CD62p-PE荧光抗体标记血小板,流式细胞术(FCM)检测对照组、低浓度BPI组(40 ng/mL)、高浓度BPI组(400 ng/mL)、AMI组和BPI抗体组(5 μg)CD41+/CD62p+活化血小板比例。分离并鉴定中性粒细胞,免疫荧光染色(MPO+Histone H3),激光共聚焦显微镜观察AMI组和对照组中性粒细胞胞外陷阱(NETs)。2.抽取STEMI患者梗死相关动脉血栓组织,CD41抗体荧光标记血小板膜糖蛋白GPⅡb(CD41),激光共聚焦显微镜观察冠状动脉粥样硬化血栓组织CD41和BPI的表达。免疫荧光染色(MPO+Histone H3+S100A8/9),激光共聚焦显微镜观察冠状动脉粥样硬化血栓组织NETs结构成分和S100A8/9蛋白的表达。3.8～10周C57BL/6野GDC-0068生型小鼠腹腔动脉新鲜抗凝全血,制备小鼠PRP和洗涤血小板。以anti-CD41-FITC和anti-CD62p-PE荧光抗体标记血小板,FCM检测对照组和BPI组(40ng/mL)小鼠CD41+/CD62p+活化血小板比例;血小板铺展实验观察血小板铺展能力;Western Blot检测血小板p-NF-κB和p-selectin蛋白的表达。4.分离并鉴定小鼠中性粒细胞,小鼠中性粒细胞分别与BPI预处理和未处理的小鼠血小板共培育。FCM检测对照组、BPI未处理血小板组、BPI预处理血小板组的小鼠中性粒细胞ROS生成。免疫荧光染色(MPO+Histone H3),激光共聚焦显微镜观察小鼠中性粒细胞NETs结构。免疫荧光染色(MPO+Histone H3+S100A8/9),激光共聚焦显微镜观察小鼠中性粒细胞NETs结构和S100A8/A9蛋白的表达。ELISA检测细胞共培养上清中S100A8/A9蛋白的浓度。5.将C57BL/6野生型小鼠随机分为3组:Sham对照组、模型组和BPI预处理组,BPI预处理组在小鼠造模前一天,经尾静脉注射鼠源BPI重组蛋白(体积200 μL,浓度0.4mg/mL),氯化铁(FeC13)诱导小鼠颈动脉血栓形成。观察小鼠颈动脉血栓形成的时间和长度;免疫荧光染色(CD41+Fibrin/MPO+Histone H3)激光共聚焦显微镜观察小鼠颈动脉血栓组织活化血小板与纤维蛋白的共表达以及NETs结构的表达;Western Blot检测血栓组织CD41和Fibrinogen蛋白的表达。[结果]1.FCM检测对照组、低浓度BPI组(40ng/mL)、高浓度BPI组(400ng/mL)、AMI组和BPI抗体组(5μg)CD41+/CD62p+活化血小板比例的平均值分别为13.9%、28.8%、38.3%、38.1%和22.1%;正常对照组活化血小板比例随加入BPI浓度的增加而升高;与正常对照组比较,AMI组活化血小板比例升高(P<0.001,AMI vs Ctrl),加入BPI中和抗体后,活化血小板比例相应降低(P<0.005,AMI vs AMI+BPI-Ab)。激光共聚焦显微镜观察(MPO+Histone H3),AMI患者外周血中性粒细胞NETosis(释放NETs结构)的比例较正常对照组增加。激光共聚焦显微镜观Genetics behavioural察可见STEMI患者梗死相关动脉血栓组织CD41和BPI的共定位以及NETs结构成分和S100A8/9蛋白的共表达。2.小鼠PRP加入BPI后,活化血小板比例增加(P<0.01;Ctrl vs BPI:16.4%vs 34.7%,t-test);Leica SPE显微镜(400倍镜)下观察,对照组小鼠血小板呈椭圆形或圆盘形,经BPI预处理后,血小板伸展较显著,由圆形变成丝状或不规则状态,体积增大;与对照组比较,经BPI预处理后,小鼠血小板p-NF-κB和p-selectin活化标志蛋白表达增加。3.小鼠外周血中性粒细胞加入BPI预处理血小板共培养后,与对照组和BPI未处理血小板组比较,BPI预处理血小板组的小鼠中性粒细胞ROS生成增加;激光共聚焦显微镜观察,出现NETs结构的中性粒细胞比例增加;并且中性粒细胞胞外S100A8/A9蛋白表达更明显。4.在FeCl3诱导的小鼠颈动脉血栓形成模型中,BPI预处理的小鼠颈动脉血栓形成的时间更短(BPI 预处理组:54.33±6.41 sec vs 模型组:70.50±7.58 sec,P<0.005)、长度更长(BPI预处理组:4.12±0.68mmvs模型组:3.12±0.36mm,P<0.01);免疫荧光染色显示,BPI预处理小鼠血栓组织CD41和Fibrin表达显著增加,CD41-fibrin共染的区域也更大,并且血栓组织中MPO和Histone H3的表达显著增加,MPO-Histone H3(NETs结构)共染的区域也更大;Western Blot检测结果显示,BPI预处理的小鼠血栓形成部位CD41和Fibrinogen蛋白的表达增加。表明BPI预处理的小鼠血栓组织,血小板GP Ⅱb/Ⅲa受体活化水平升高,血小板GP Ⅱb/Ⅲa受体与纤维蛋白原的结合能力增强,中性粒细胞NETosis增强。[结论]1.冠状动脉粥样硬化患者血浆BPI表达水平升高,与机体炎症水平和冠状动脉粥样硬化病变严重程度正相关,并且增加血栓形成倾向和MACEs事件发生率,是预测MACEs事件的独立危险因素。AMI患者血浆BPI表达水平升高,且与中性粒细胞NETosis标志物正相关。表明在冠状动脉粥样硬化血栓形成过程中,BPI与中性粒细胞NETosis存在机制上的关联,BPI促进冠状动脉粥样硬化血栓形成。2.在体外,BPI可以激活血小板,增强血小板聚集功能、铺展能力,增加血小板p-selectin的表达和NF-κB磷酸化修饰。BPI活化的血小板,通过血小板-中性粒细胞相互作用,增加中性粒细胞ROS生成,增强中性粒细胞NETosis。在小鼠体内,BPI可以激活血小板,增加血小板和纤维蛋白原的结合,增强中性粒细胞NETosis,促进动脉血栓形成。3.临床上BPI可能成为急性心肌梗死一个有前景的生物标志物,从而为急性心肌梗死的早期诊断、病情评估提供可靠的参考依据。