由于世界人口逐年增加,以及平均年龄逐年提高,我们正在迈向一个更加严峻的社会,其中骨质疏松症(Osteoporosis,OP)患者也在逐年攀升,这一病症对于中老年患者来说,是一个严峻而又棘手的挑战。OP是一种严重的骨骼疾病,它会造成骨骼的损伤,使骨骼变得更容易断裂,从而引发骨折。它有两种类型:原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症,其中原发性骨质疏松症一般出现在绝经后妇女,而继发性骨质疏松症青少年患者更多,常常低能量损伤即可导致脊柱、腕部及髋部骨折,给患者造成极大痛苦,并增加医疗负担。骨骼是intrauterine infection一个功能多样和不断运动和变化的重要器官,可以支持人体运动系统的活动,维持钙和磷酸盐等矿物质的代谢平衡,为了保证骨组织中微环境的稳态,满足人体活动的需要,骨骼组织不断消融再生,称之为骨重建,骨重建主要由骨组织骨重建腔中的破骨细胞(Osteoclasts,OC)、成骨细胞(Osteoblast,OB)和骨细胞完成,骨重建失衡是骨质疏松症患者骨微结构损伤的主要因素。破骨细胞来源于血液中的单核前体细胞,它是目前被发现的人体中唯一的骨吸收细胞,它可以产生一些酶,这些酶具有骨组织中矿物盐的酸溶解和有机物降解的功能,它们会粘附在骨组织表面行使骨吸收的功能。当破骨细胞在某些病理条件下过度表达时,骨重建失衡,骨微结构损伤,导致OP。抗骨质疏松药物可改善OP,但也会引起许多副作用,包括胃肠道不耐受、骨坏死、骨肉瘤和癌症,因此,对安全且更有效的抗骨质疏松药物有很大的需求。近年来,随着对自然植物提取物的日益重视,它们被认为是一种有效的预防和治疗人类疾病的药物,因为它们的取材范围广泛,副作用较小。异牡荆黄素(Isovitexin,IVX),是许多中药的活性黄酮类成分,是芹菜素的C-糖基化衍生物,广泛分布于自然界中的许多果蔬中,异牡荆黄素具有多种生物活性,包括抗氧化、抗癌和神经保护作用。据报道,IVX通过调节Nrf2/NF-κB信号通路来保护细胞免受炎症,但对NF-κB信号通路介导的破骨细胞导致的骨质疏松症尚无报道。因此本实验的主要研究目的是探讨异牡荆黄素在体外诱导破骨细胞前体分化成破骨细胞过程中的影响和分子机制,找到破骨细胞相关性骨质疏松药物治疗的可行性靶点。方法:1.利用核因子NF-κB受体活化因子配体(RANKL)的影响,我们构建了一个有效的破骨细胞培养体系,以RAW264.7细胞作为基础,采用DMEM培养基、α-MEM培养基,对其进行培育,从而达到定向分化的目的。通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色(Tartarate resistant acid phosphatase,TRAP)技术,我们可以准确地识别出符合实验要求的破骨细胞,并且可以评估它们的分化能力。2.为得到其安全使用浓度,采用细胞活性测定实验法(cck-8)检测、分析不同浓度下的异牡荆黄素对破骨细胞前体及破骨细胞分化的毒性作用。3.采用Corning骨检测微孔板进行骨吸收功能试验,选择20μM、40μM、60μM的异牡荆黄素溶液,观察其对破骨细胞骨吸收功能的抑制效Liraglutide分子量果;4.对破骨细胞特有的成熟细胞骨架肌动蛋白环(F-actin ring)进行鬼笔环肽染色,观察异牡荆黄素对其生成的影响。5.通过聚合酶链式反应(PCR),研究了异牡荆黄素在(20μ、40μ、60μ)浓度时,c-Fos基因及NFATc1基因的表达情况;此外,还使用Western blotting方法,研究异牡荆黄素与c-Fos基因及NFATc1基因的相关性。6.使用SPSS26.0软件,单因素方差分析的方法(one-way ANOVA)检验,分析实验目标的统计学特征,所有实验至少重复三次。结果:1.在体外成功建立起RAW264.7细胞系诱导的破骨细胞体系。2.通过用不同浓度的异牡荆黄素(20μM、40μM、60μM),对细胞进行细胞毒性检测,发现在实验浓度下对破骨细胞的分化并没有毒性,其中包括破骨细胞及破骨细胞前体细胞。经过研究发现,当使用不同浓度的异牡荆黄素进行刺激时,破骨细胞的产出会大幅减少,而这种减少会导致它们的发育被严重阻碍,而当超出预期的浓度时,这种阻碍会变得更为突出。3.在骨检测微孔板检测破骨细胞吸收的实验结果中,在本次实验研究中所使用的异牡荆黄素浓度(20μM、40μM、60μM)的凹坑面积与对照组相比,实验组凹坑面积显著降低,在60μM时最为明显,并且两者之间存在统计学差异(P<0.05),且随着异牡荆黄素浓度的提升,骨凹坑面积越小,其抑制作用更加显著。肌动蛋白环染色实验结果显示随着异牡荆黄素浓度的提升对OC肌动蛋白环数量生成具有抑制作用,在60μM时最为明显;4.分析在异牡荆黄素刺激破骨细胞后,主要转录因子c-Fos和NFATc1 m RNA的表达水平,与对照组比较,实验组转录活性表达在20μM、40μM、60μM范围内,随着IVselleck激酶抑制剂X浓度的增加,抑制作用逐渐增强,在60μM时最为明显,组间对比存在统计学差异,且具有显著特征。经过蛋白质印迹分析,异牡荆黄素能够显著减少RANKL介导的c-Fos和NFATc1蛋白的表达,从而有效地阻止破骨细胞的生长,这种效果从分子层面上得到了更加深入的认识。结论:异牡荆黄素在体外能够通过调节RANKL介导的信号通路来抑制破骨细胞分化,减弱转录因子c-Fos和NFATc1的活性表达,从而抑制相关蛋白的生成,且在20-60μM浓度区间之内,抑制效果与浓度呈正相关呈剂量依赖性的方式,这为开发针对破骨细胞病理性过度表达相关性骨质疏松症药物治疗提供可行性靶点。