背景:鼻咽癌(NPC)是一种常见的头颈部鳞状细胞癌,是呼吸系统最常见和最致命的LGK-974 IC50癌症之一。目前对于鼻咽癌的治疗效果不尽人意,寻找高效、低毒的新型抗鼻咽癌天然药物已成为治疗鼻咽癌的研究热点。广陈皮来源于茶枝柑(Citrus reticulata’Chachi’)的干燥成熟果皮,兼具“药”、“食”两用特色,在医药和健康食品领域应用广泛。广陈皮中含有丰富的多甲氧基黄酮类成分(polymethoxyflavonoids,PMFs),研究表明广陈皮PMFs成分是各种癌症的潜在抗癌剂,具有多种生物活性,尤其在呼吸系统疾病中具有良好疗效,但由于PMFs黄酮骨架上存在多个甲氧基取代基,其溶解度低、吸收差和生物利用度低限制进一步的广泛应用。脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微小型囊,可以包裹药物尤其是疏水性药物从而提高药物的生物利用度、延长药物在体内的作用时间、提高药物稳定性且具有良好的安全性等。低溶解度和分散性差的生物活性成分在体内不能很好地吸收,导致药理活性差,因此,本文从广陈皮中富集PMFs有效部位,并制备包载广陈皮PMFs脂质体(Lip-PMFs),通过透射电镜(TEM)、粒径、多分散指数(PDI)、zeta电位(ZP)、包封率(EE)对脂质体囊泡进行理化性质表征。此外,结合体内药代动力学和体内体外药效动力学实验考察Lip-PMFs在生物利用度和抗鼻咽癌活性上的潜力和疗效,以期为鼻咽癌等呼吸系统疾病的治疗、广陈皮及PMFs的开发利用提供新的思路。目的:(1)富集并分离广陈皮PMFs有效部位,提高样品的利用率,为后续PMFs生物活性研究提供基础,促进广陈皮PMFs的开发和利用。(2)制备负载广陈皮PMFs脂质体(Lip-PMFs),并进行理化性质表征及稳定性考察。(3)考察构建的Lip-PMFs对人鼻咽癌细胞的体外抑制作用。(4)从体内角度考察Lip-PMFs药代动力学行为和抗鼻咽癌疗效。方法:(1)溶剂优化后采用石油醚回流提取富集广陈皮PMFs有效部位,并采用UPLC-Q-ExacMK-2206tive Orbitrap/MS、UV、HPLC法进行定性定量分析确定其物质基础。(2)处方优化后通过薄膜分散-高压均质法制备Lip-PMFs,并通过透射电子显微镜(TEM)观察Lip-PMFs形态、马尔文粒径仪测定其粒径和zeta电位、微柱凝胶法测定包封率;此外对Lip-PMFs进行体外模拟胃肠液释放研究和稳定性考察。(3)通过CCK8实验、细胞克隆形成实验、流式细胞术实验、Hoechst染色实验、细胞划痕实验、transwell侵袭实验考察Lip-PMFs对人鼻咽癌细胞CNE-2增殖、凋亡、迁移、侵袭能力的影响。(4)建立Lip-PMFs体内大鼠药代动力学实验,并应用于大鼠血浆中PMFs成分浓度监测;此外,建立CNE-2裸鼠肿瘤异种移植模型,进一步验证Lip-PMFs对鼻咽癌的体内抑制作用。结果:(1)广陈皮PMFs有效部位提取产率达0.65%,其中共有8种PMFs成分被鉴定,包括6-去甲氧基橘皮素(6-DMT)、异泽兰黄素、川陈皮素、金腰乙素、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黄酮(HMF)、橘皮素、5-羟基-6,7,8,3′,4′-五甲氧基黄酮(5-HPMF)和栀子黄素B;PMFs纯度达85.86±6.24%,其中川陈皮素、橘皮素、5-HPMF、6-DMT、HMF通过HPLC技术进行了定量分析,含量分别为38.85%±1.41%、30.35%±0.52%、2.68%±0.52%、1.98%±0.34%和0.68%±0.01%。(2)制备的Lip-PMFs外观为乳白色液体,在TEM观察下发现为球形囊泡,大小均匀,约为50 nm。脂质体平均粒径为70.94±0.82nm,多分散指数(PDI)小于0.2,与TEM观察结果一致,ZP值为-3.02±0.36m V,Lip-PMFs表面带负电,包封率达80%以上;且相比游离PMFs,脂质体包裹的PMFs溶解度提高了15.70倍。此外,体外模拟胃肠液释放研究结果表明Lip-PMFs具有显著的缓释效果,游离PMFs 18 h后在人工胃液(SGF)和人工肠液(SIF)中均迅速完全释放;而Lip-PMFs在SGF中的释放在18 h内增加至59.57%±2.48%,然后在98 h释放完全;SIF中Lip-PMFs的释放在18 h内增加到76.90%±5.50%,然后在48 h释放完全。同时,Lip-PMFs在4和25℃的15d储存下仍然保持稳定,PMFs的包封率仍达80%以上。(3)体外药理实验结果表明,PMFs在体外抑制人鼻咽癌细胞CNE-2增殖、迁移、侵袭和促进细胞凋亡,并且Lip-PMFs的效果与完全溶解在DMSO中的PMFs(DMSO-PMFs)效果相当,两者抗鼻咽癌细胞作用均明显优于分散在水溶液中的PMFs(AQPMFs)。(4)与游离PMFs相比,Lip-PMFs口服吸收和相对口服生物利用度显着增加,Lip-PMFs中的川陈皮素相对口服生物利用度相比游离PMFs提高了1.78倍,Lip-PMFs中的橘皮素相对口服生物利用度相比游离PMFs提高了5.73倍。药时曲线图表明,在同一时间点,Lip-PMFs中的川陈皮素和橘皮素在血浆中的浓度显着高于游离PMFs,Lip-PMFs中的川陈皮素和橘皮素在血浆中均可持续12 h,而游离PMFs中的川陈皮素在10 h后低于定量限,而橘皮素在5 h后也无法达到定量限。此外,成功建立了鼻咽癌CNE-2荷瘤动物模型,与生理盐水组相比,PMFs处理后能够抑制裸鼠体内移植瘤的生长,而Lip-PMFs处理的小鼠的肿瘤负荷远低于游离PMFs处理的小鼠。肿瘤病理切片H&E染色和Ki-67免疫组化显示,与PMFs组相比,生理盐水组裸鼠的肿瘤组织坏死更严重,而Intervertebral infection游离PMFs和Lip-PMFs处理后明显抑制体内肿瘤细胞增殖,与体外实验结果一致。结论:(1)石油醚是富集PMFs的良好溶剂,选择性高,经石油醚回流提取的PMFs提取物纯度较高,且提取物中含有丰富的PMFs成分。(2)LipPMFs具有粒径小、粒径分布均匀、表面负电荷、分散性好、包封率高、缓释型好等特点,且具有良好的稳定性。(3)疏水性PMFs可以有效地包裹在脂质体中,与游离PMFs相比,Lip-PMFs对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用更强,对细胞凋亡的诱导作用更强,且具有良好的安全性。(4)脂质体包裹后提高了PMFs的生物利用度和增强了体内抗肿瘤作用。