研究背景和目的狼疮性肾炎(Lupus nephritis,LN)是系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)常见和严重的并发症,也是SLE患者主要的死亡原因。目前,临床上LN常规的实验室检查,如尿蛋白、抗双链DNA抗体等对LN诊断的敏感性和特异性都十分有限。有创的肾穿刺活检病理虽是LN诊断的“GSK J4作用金标准”,但LN病理NIH(National Institutes of Health)评分对LN患者长期预后的预测并没有被LN协助研究组所认同和肯定。缺乏可靠、精准的LN标记物是目前LN患者治疗和管理仍不理想的重要原因之一。因此,本研究首先利用近年迅猛发展的生物信息学技术结合机器学习算法筛选潜在的LN诊断标记物,结果认为干扰素诱导蛋白16(Interferon-inducible protein 16,IFI16)可能作为LN诊断的一个新的生物标记物。IFI16属于干扰素诱导p200蛋白家族成员,具有抑制细胞转录、抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡等多种生物学功能。越来越多的报道将IFI16与自身免疫性疾病联系在一起,SLE、干燥综合征、系统性硬化病和类风湿性关节炎患者血清中均能检测到IFI16蛋白和抗-IFI16抗体。SLE和系统性硬化病的病变皮肤组织中也能够检测到IFI16蛋白的明显高表达。尽管研究显示IFI16的异常表达与SLE密切相关,但IFI16能否作为LN诊断的生物学标记物目前尚未见有明确报道,更未见有对LN患者肾组织中IFI16蛋白定位表达的相关检测。本研究在生物信息学筛选出IFI16作为LN诊断标记物的基础上,以LN患者为研究对象,检测IFI16能否作为LN诊断和判断病情及预后的新的生物学标记物,并探讨LN肾内IFI16表达可能的作用机制。研究材料和方法1.于高通量基因表达(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中筛选并下载来自LN和对照组样本的数据集GSE32591、GSE99339作为训练集,确定LN差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),采用最小绝对收缩和选择算子(Least Absolute Shrinkage and Selection Operator,LASSO)、随机森林(Random Forests,RF)以及支持向量机递归特征消除(Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination,SVM-RFE)三种机器学习算法分别构建LN诊断模型;选出三种诊断模型都认定的基因作为潜在的LN诊断的生物标记物。再以GSE104948数据集作为验证集,验证上述挑选出的生物标记物对LN的诊断效能。2.选取104例LN患者肾穿刺蜡块标本,同时选取12例糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)、12例微小病变(Minimal change disease,MCD)和12例Ig A肾病(Ig A nephropathy,Ig AN)患者肾穿刺蜡块标本作为疾病对照组,14例正常对照(Normal controls,NC)标本来自肾癌切除肾脏,取远离肾癌的相对正常肾组织。免疫组织化学染色方法检测肾组织内IFI16表达,分析肾IFI16表达与LN的病理改变以及LN患者各临床指标的相关性。对LN患者随访26个月,分析LN肾内IFI16表达与LN患者预后的相关性。3.多重免疫荧光染色检测LN肾内IFI16定位细胞表达,以及肾内IFI16表达与增殖细胞的定位关系。4.收集经肾穿刺病理确诊为LN患者的血清样本34例,同时收集正常人血清样本20例作为健康对照组。通过酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测LN患者及健康对照组血清中IFI16水平;分析LN患者血清IFI16水平与LN的病理改变以及LN患者各临床指标的相关性。5.对LN中IFI16进行基因集变异分析(Gene Set Variation Analysis,GSVA)和基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA),以及用CIBERSORT算法分析LN肾IFI16表达与不同免疫细胞浸润的相关性。研究结果1.生物信息学结合机器学习,LASSO算法构建的LN诊断模型中共纳入14个基因;SVM-RFE算法仅纳入2个基因;RF算法纳入基因30个。IFI16基因是被三种算法都纳入在诊断模型之中的基因。训练集及验证集均显示相较于对照组,LN组IFI16呈明显高表达,表明IFI16可能是LN新的诊断生物标记物。2.LN肾穿刺组织IFI16免疫组化染色显示,在肾组织的肾CL 318952分子量小球和肾小管间质中均见有明确的细胞核IFI16阳性表达。与DKD、MCD、Ig AN的疾病对照以及NC相比,LN肾组织内的肾小球和肾小管间质IFI16表达明显高于其相应的各对照组,即LN肾组织IFI16呈明显高表达。同时,Ⅳ型LN中肾小球IFI16表达明显高于Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅴ型LN;而肾小管间质IFI16表达在各型LN中未见有明显差异。3.多重免疫荧光染色结果显示,肾小球内可见IFI16蛋白与肾小球的足细胞(WT1)、系膜细胞(ITGA8)以及肾小球毛细血管的内皮细胞(CD31)呈明确的共定位表达。此外,IFI16还与LN肾小球内浸润的各种炎细胞呈共定位表达,其中包括单核/巨噬细胞(CD68)、T-淋巴细胞(CD3)、B-淋巴细胞(CD20)和中性粒细胞(MPO)。在LN肾小管间质中,IFI16与肾小管间质区内浸润的炎细胞(单核/巨噬细胞、T、B淋巴细胞和中性粒细胞)也表现出明确的共定位表达。多重免疫荧光染色法检测IFI16与Ki-67(标记处于分裂增生期细胞)和IFI16与p53蛋白的共定位,结果发现在LN肾组织中,肾内Ki-67和IFI16共定位细胞仅占IFI16阳性细胞总数的2.7%,提示LN患者肾组织内表达IFI16的细胞处于非分裂增殖期。IFI16与p53的多重免疫荧光染色则显示IFI16蛋白与p53蛋白明确的共定位表达,提示LN肾组织细胞内存在IFI16与p53蛋白的相互作用。4.肾组织内IFI16表达与LN患者的病理相关性分析显示,肾小球IFI16表达与LN病理的活动性指数(Activity index,AI)评分呈明显正相关,而与病理慢性指数(Chronicity index,CI)评分无明显相关性。同时肾小球IFI16表达与组成AI评分的各单项得分(包括肾小球毛细血管内细胞增生、中性粒细胞浸润/核碎、以及细胞性/细胞纤维性新月体形成)也呈明显的正相关性。肾小管间质IFI16表达虽与病理的AI评分无明显相关性,但在肾间质有炎细胞浸润的LN患者中,肾小管间质IFI16urine biomarker表达明显高于间质无炎细胞浸润的LN患者。此外,慢性病变的LN患者中,肾小管间质IFI16表达明显高于无慢性病变的LN患者,说明LN肾小管间质IFI16表达主要与LN病理的CI评分呈正相关。临床相关性分析显示,肾小球IFI16表达与LN患者的SLE疾病活动性指数(SLE Disease Activity Index,SLEDAI)、血肌酐水平,以及血尿程度(每高倍视野红细胞数)呈明显正相关;而与LN患者血清补体C3和C4水平以及估算的肾小球滤过率(Estimated glomerular filtration rate,eGFR)值呈负相关。肾小管间质IFI16表达与LN患者的SLEDAI评分及血肌酐水平呈明显正相关性,而与eGFR值呈负相关。以上说明肾IFI16表达与LN的活动性病变和LN疾病的严重程度呈正相关。5.104例LN中有52例患者资料纳入预后风险分析。随访26个月,以血清抗双链DNA阳性转为阴性以及eGFR下降超基线eGFR的50%(eGFR下降≥50%)作为预后终点事件。在校正年龄、性别、尿蛋白、基础肌酐和高血压后,多因素Cox风险分析显示,肾小球IFI16高表达是预测LN患者eGFR下降的独立危险因素。肾小球IFI16高表达以及肾小球结合肾小管间质IFI16高表达是预测抗双链DNA抗体转阴率下降的独立危险因素。提示肾IFI16可能作为LN患者预后预测的新的标记物。6.ELISA检测血清IFI16水平发现LN患者血清IFI16平均水平明显高于健康对照组,但LN患者血清IFI16水平与LN患者的临床各指标(包括SLEDAI、血肌酐、尿红细胞、补体C3、C4水平及eGFR等)均无明显相关性,且与LN肾病理AI和CI也无明显相关性。7.GSEA分析显示LN中IFI16高表达富集有活动性免疫应答、适应性免疫应答和α/βT-细胞的激活。CIBERSORT算法表明IFI16与肾内单核细胞及活化的树突状细胞浸润呈明显的正相关。提示LN肾内IFI16表达可能参与局部的适应性免疫应答。研究结论LN患者肾组织内IFI16表达与LN患者肾脏受累程度、疾病活动和严重程度呈明显正相关。肾IFI16表达增高与LN患者不良预后密切相关。肾组织内IFI16的检测可能作为LN疾病活动和LN患者预后预测的新的生物学标记物。