小麦作为我国重要的粮食作物,对国家粮食安全和经济稳定具有重要作用。小麦杂种优势的利用能够增加作物产量,而雄性不育是利用杂种优势的一种有效途径,因此,育性调控基因的挖掘及其调控育性的分子机制研究对于小麦育种研发与利用具有深远的意义。本试验以新型的小麦温敏核雄性不育(TGMS)系偃展4110S和其近等基因可育系偃展4110为研究材料,通过不同温度处理条件下的表型和细胞学观察,如植株的外部形态、花器官特征、绒毡层、小孢子以及花粉壁的发育过程等,明确育性转换的基本特征。为了深入探究育性调控的分子机制,利用转录组测序和育性相关基因的差异表达分析,大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默,模式植物拟南芥中过表达,以及敲除试验,验证相关基因与雄性育性变化的关系,并以此提出一条可能的育性调控模型。研究的主要结果如下:1.表型和细胞学观察结果显示,偃展4110S花器官的雌蕊发育正常,而其具有以下育性转换的特征:雄性不育植株穗子中的小花呈现炸裂状态;花药发育异常的时期ocular pathology是三核期,呈淡黄色且瘦小不开裂,外表皮纤维凹凸不平,纤维细胞杂乱交叉排布;花粉粒皱缩畸形,萌发孔塌陷;花粉粒的I_2-KI溶液染色不充分,表现为染败。TUNEL、组织切片和超微结构观察表明,绒毡层细胞的降解发生延迟,小孢子发育至成熟的花粉粒的过程出现异常,最终花粉外壁的顶盖萎缩畸形。由此推测,在高温条件下,偃展4110S发生育性转换的可能原因是绒毡层的延迟降解,不能适时地给予小孢子发育过程中所需要的营养物质,从而导致小孢子发育过程异常,最终花粉外壁缺陷而不育。2.不同温度条件,偃展4110S和偃展4110单核晚期花药的转录组测序结果表明,1422个差异表达基因是偃展4110S特有的差异表达基因。与利用WGCNA确定的核心基因集合(1340个差异表达基因)比对分析,发现核心基因集合中的一些基因与偃展4110S特有差异表达基因相一致。为了更加精确的寻找与雄性育性密切相关的基因集合,通过上述两个基因集合的交集分析,及在花药中特异表达的基因作为筛选目标,挖掘3个分别与花粉,花粉壁,及绒毡层发育相关基因TaLIM2、TaGELP073和TaGAMYB。3.小麦LIM和GELP基因家族分析表明,分别鉴定到的29和509个成员在小麦基因组中分布不均匀。TaLIMs基因分为2类,包括DA1&DAR亚家族和CPR-like亚家族;TaGELP基因家族可分为8个亚家族,且不同的分支包含的TaGELPs成员数量差异显著。基因结构和保守基序分析表明,各个小分支的成员进化是相对保守的,其顺式作用元件参与激素,植物发育,生物和非生物胁迫响应等。偃展4110S中不育和可育花药表达量分析表明,这些家族成员基因可能参与了育性转换过程中的花粉发育。为了证实这种猜测,对从转录组数据库中获得的差异表达基因TaLIM2和TaGELP073进行基因瞬时沉默和过表达分析,发现沉默植株的花药中小孢子和花粉外壁发育缺陷。TaLIM2过表达系植株抽薹时间与野生型相比提前,TaLIM2-g拟南芥过表达系花粉活力降低,花粉管几乎不萌发且果荚不饱满。TaGELP073同源基因At GELP5050和At GELP1890的双突变体gelp5050 gelp189PS-341抑制剂0植株果荚部分变短,育性下降,说明基因TaLIM2和TaGELP073与偃展4110S的育性密切相关。4.TaGAMYB沉默植株的花药超微结构观察发现,沉默株花药的绒毡层与花粉外壁发育缺陷。为全面探究该基因功能,在可育和不育的偃展4110S中分别克隆了TaGAMYB编码序列(暂命名TaGAMYB-d和TaGAMYB-g),两序列存在3个核苷酸差异。进化树分析表明,At MYB97、At MYB101、At MYB120与TaGAMYB-d、TaGAMYB-g的亲缘关系最近。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建拟南芥myb97 myb101 myb120三基因突变体,发现该突变体花粉萌发率和育性下降。TaGAMYB-d过表达系虽然开花提前,但育性正常,而TaGAMYB-g过表达系花粉活力和萌发率降低,育性下降,说明TaGAMYB同样与偃展4110S的育性密切相关,且高温能致育性下降。5.赤霉素处理可育条件下的偃展4110S,可见其花药瘦小,花粉粒不能被I_2-KI和亚历山大染液染色并呈现皱缩形状,花粉管不生长,结实率显著下降,花药GA3含量均高于对照。q RT-PCR表明,GA3处理条件下,TaGAMYB的表达水平降低,且二核期和三核期更为显著,说明TaGAMYB的表达受GA3影响。酵selleck合成母单杂和双荧光素酶实验表明,小麦TaWRKY2可以结合在TaGAMYB的启动子上,调控其基因表达,且GA3处理后的花药中TaWRKY2在各时期均上调差异表达。因此推测,GA3可能通过TaWRKY2抑制TaGAMYB的表达,进而影响花粉外壁形成相关基因PAL和FLS的表达而调控偃展4110S的育性。综上,TGMS小麦偃展4110S的育性转换可能由TaGAMYB通过赤霉素信号调节。