小麦液泡分选蛋白基因TaSAL1的进化分析和功能研究

真核生物进化中,内体蛋白分选转运复合体(The endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)是一个在结构和功能上都保守的复合体,可以调节多囊泡体/液泡前体(Multivesicular body/Prevacuolar compartment,MVB/PVC)中腔内小泡(Intraluminal vesicles,ILVs)的形成,参与泛素化的膜蛋白降解过程。因此,ESCRT各亚基及其辅助蛋白影响着植物的生长和发育过程。植物ESCRT复合体由TOL蛋白家族、ESCRT-I、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ和VPS4/SKD1组成,CHMP1(Chromatin Modifying Protein;Charged Multivesicular Body Protein 1)是ESCRT-Ⅲ的辅助蛋白,能够与VPS4/SKhepatic cirrhosisD1结合,调控ESCRT-Ⅲ复合体亚基的解体和从内体膜上的解离。目前,CHMP1蛋白的相关研究主要集中在酵母及哺乳动物中,植物中的CHMP1蛋白具体的功能及其调控机制仍有待研究。本研究在小麦基因组中鉴定及克隆到玉米Zm SAL1(CHMP1在玉米中的同源物)的同源基因TaSAL1,并利用CRISPR-Cas9技术创制小麦TaSAL1基因编辑突变体。最后,通过遗传分析和表型鉴定的方法对小麦TaSAL1的CHIR-99021体外生物学功能进行初步研究。主要研究结果如下:1.基于同源比对方法,我们鉴定并克隆出小麦中TaSAL1的三个同源拷贝TaSAL1-A、TaSAL1-B及TaSAL1-D。另外,不同物种ESCRT组分及CHMP1蛋白的系统进化分析结果表明,TaSAL1属于VPS46亚类,且CHMP1蛋白在进化上高度保守。2.基于小麦公共转录组数据,我们发现TaSAL1的同源拷贝在小麦各个组织中都有表达。亚细胞定位结果表明,TaSAL1蛋白在烟草叶肉细胞中呈斑点状分布,与细胞器标记(细胞核、高尔基体和细胞膜)没有共定位,但与内质网相关。3.TaSAL1敲除突变体及其PORCN抑制剂后代的基因型鉴定结果显示,突变体aa Bbdd和Aabbdd表现出异常的自交分离比,纯合基因型突变体aabb DD和aabbdd均无法获得。通过突变体aa Bbdd与野生型AABBDD的正反交遗传分析,我们推测TaSAL1-abd雄配子体生物发生异常,该种基因型雄配子传递率仅为11.4%。4.田间及温室环境下突变体与野生型的表型考察结果显示,突变体aa Bbdd和Aabbdd均表现出分蘖数目减少、株高降低和抽穗期延迟现象。5.突变体aa Bbdd及野生型AABBDD的籽粒代谢组结果表明,激素类代谢物在突变体及野生型间呈现显著性差异。其中,突变体aa Bbdd的生长素、赤霉素和脱落酸含量显著增加,细胞分裂素含量显著降低。综上所述,本研究成功克隆小麦TaSAL1三个同源拷贝,初步探讨了TaSAL1影响雄配子体生物发生和胚胎发生,以及可能通过介导激素途径来影响小麦株型的塑成,并为进一步探索ESCRT亚基及辅助蛋白在植物中的功能提供了理论参考。