弓形虫是一种可以感染几乎所有温血动物的人畜共患寄生原虫,作为专性的胞内寄生原虫,其生长繁殖所Imidazole ketone erastin说明书需要的营养物质几乎全部直接来源于宿主细胞。因此,虫体不仅可以通过调整自身的代谢活动来适应复杂多样的寄生环境,同时还能调节宿主细胞的代谢活动使之能够满足虫体快速增殖的营养需求,但是目前关于弓形虫调节宿主细胞代谢活动获取生长所需营养物质的作用机制还知之甚少。本研究发现弓形虫感染会激活宿主细胞的能量稳态调控蛋白——单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK),AMPK是在真核生物中高度保守的一种含α、β、γ亚基的异源三聚体蛋白复合物,通过响应细胞内ATP/AMP或ATP/ADP比值变化,并在其α催化亚基T172位点发生磷酸化而活化,继而磷酸化其下游底物激活AMPK代谢调控通路,通过促进产生能量的分解代谢和抑制消耗能量的合成代谢过程,在维持细胞代谢平衡和能量稳态中扮演着重要角色。本课题以宿主细胞AMPK为切入点,通过经典遗传学、定量蛋白质组学、化学遗传学等方法探究宿主细胞AMPK对弓形虫生长的影响及作用机制。具体研究内容如下:1.弓形虫速殖子感染导致宿主细胞AMPK的激活弓形虫速殖子RHΔhxgprt虫株感染HFF、MEF、293T细胞后,发现宿主细胞AMPKα磷酸化水平升高。进一步研究发现,宿主细胞AMPK的活化依赖虫体在胞内的生长和宿主细胞活性氧(ROS)的产生。在感染早期,弓形虫的生长会增加宿主细胞AMPKα的磷酸化水平。此外,弓形虫感染还能引起宿主细胞ROS增加,当用活性氧清除剂(NAC)消除升高的ROS后,宿主细胞AMPKα的磷酸化水平出现下降。上述结果揭示弓形虫的生长和感染引起宿主细胞增加的ROS可以激活宿主细胞的AMPK。2.宿主细胞AMPK通过改变自身代谢和生物进程影响虫体的生长为分析宿主细胞AMPK对弓形虫生长的影响,利用RHΔhxgprt虫株感染MEF和AMPKα~(-/-)MEFs细胞,结果发现弓形虫在高密度AMPKα~(-/-)MEFs细胞中出现严重的生长缺陷,这种缺陷在外源添加谷氨酰胺时可以得到部分改善。经检测发现,在感染弓形虫后,与对照组MEF细胞相比,缺失AMPKα的MEF谷氨酰胺转运蛋白ASCT2的转录水平和蛋白水平都不再发生上调,由此推测弓形虫感染激活的宿主细胞AMPK可能参与调控宿主细胞中的谷氨酰胺摄取途径。通过定量蛋白质组学研究发现弓形虫感染导致宿主细胞多个代谢酶表达水平发生显著变化,KEGG和GO通路分析显示感染细胞组差异蛋白主要与中心碳代谢、脂质代谢、内体运输、自噬、氧化应激等生物进程相关。而且脂肪酸摄取量和线粒体膜电位检测结果显示,AMPKα~(-/-)MEFs细胞中生长的弓形虫对宿主脂滴来源的脂肪酸摄取量和线粒体膜电位均降低,与蛋白组学分析结果相符。这说明弓形虫生长需要宿主细胞AMPK的激活,活化的AMPK通过参与宿主细胞多种代谢和生物进程的调节为虫体的生长提供营养条件。3.奥利司他以宿主细胞AMPK为靶点抑制弓形虫速殖子体外生长AMPK广泛的代谢调节功能使之成为代谢疾病治疗药物研发的靶点,目前已经成功研制出了多种通过作用于AMPK治疗人类代谢性疾病的药物,本研究从这些代谢疾病治疗药物中选取了四种AMPK激活剂(二甲双胍、丙戊酸、千金藤素和奥利司他)和一种AMPK抑制剂(氟哌啶醇)研究是否存在可通过靶向作用于宿主细胞AMPK抑制弓形虫生长的药物。体外抗弓形虫药物筛选实验结果显示,氟哌啶醇、千金藤素和奥利司他能够抑AY-22989核磁制弓形虫速殖子在体外的生长。进一步研究发现,在AMPKα~(-/Biomass digestibility-)MEFs细胞中,氟哌啶醇和千金藤素仍可抑制虫体的体外复制能力,而奥利司他对虫体的体外复制能力却没有抑制作用。这说明氟哌啶醇和千金藤素可能是通过靶向虫体的AMPK抑制其体外生长,而奥利司他是靶向宿主细胞AMPK来抑制弓形虫速殖子的体外生长。综上所述,本研究发现弓形虫感染能够激活宿主细胞的AMPK,调节宿主细胞的代谢活性为虫体提供营养物质,使之能够支持虫体在胞内的生长繁殖。宿主细胞AMPK持续性的激活不利于虫体的正常生长,也使宿主细胞AMPK有望成为治疗急性感染弓形虫病的药物潜在靶点。本研究以阐明虫体如何调节宿主代谢活动来实现持久性感染和快速增殖,为解析弓形虫在寄生环境中生存的代谢策略和弓形虫病的治疗提供理论基础。