背景:奶牛乳房炎是奶牛养殖业中高发的感染性疾病。格氏乳球菌(Lactococcus garvieae,L.garvieae)是导致奶牛乳房炎的病原菌,对奶牛生产性能具有较大负面影响。由于其表型与其他常见的乳房炎病原菌高度相似,导致该病原菌在鉴定时发生误判,从而严重低估了其在乳房炎上的发病率。迄今为止,格MLN8237作用氏乳球菌在我国奶牛场流行情况、致病性及其致病机制鲜有报道。目的:本研究旨在对我国大型奶牛场临床乳房炎奶样中分离的格氏乳球菌进行生物表型和基因特征分析,通过临床治疗数据和奶厅动态监测来研究格氏乳球菌乳房炎对奶牛生产性能造成的影响和可能的发病原因;使用格氏乳球菌对小鼠乳腺和奶牛乳腺上皮细胞分别进行体内和体外试验,间接阐明其对奶牛乳腺造成的影响,并探究格氏乳球菌通过TLR2/NLRP3/NF-κB信号通路导致MAC-T细胞损伤的可能性。方法:通过从19个省份84个大型奶牛场采集1441份临床乳房炎奶样,经病原菌培养结合形态学和16S r RNA基因测序,鉴定奶样中病原菌并获得格氏乳球菌菌株,研究格氏乳球菌在我国大型奶牛场的流行情况;通过生长曲线、生化试验和药敏试验进行表型研究;通过临床乳房炎治疗研究和奶厅动态监测探immune variation究格氏乳球菌乳房炎易感性增加的可能原因。将奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)分别和49株格氏乳球菌共培养,进行乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放量检测,以区分强、弱毒株;对强毒株LG(Lactococcus garvieae)41进行细菌基因组从头测序,鉴定格氏乳球菌和常见革兰氏阳性乳房炎病原菌之间的共线性关系,对2株弱毒株LG5和LG47以强毒株LG41为参考基因组进行重测序比较与强毒株LG41的亲缘关系;通过检测49株格氏乳球菌的毒力基因,研究不同毒株毒力基因差异。建立格氏乳球菌感染小鼠乳腺炎模型,从体内试验比较格氏乳球菌强、弱毒株的致病性;通过强毒株LG41攻菌和对照组小鼠乳腺m RNA差异表达基因生物通路和功能富集分析,确定格氏乳球菌单一因素是否能够引起小鼠乳腺炎,及强毒株引起乳腺炎的分子机制;通过不同药物对小鼠乳腺炎模型的治疗,研究不同类型的药物对格氏乳球菌乳腺炎的治疗效果。建立格氏乳球菌强、弱毒株感染奶牛乳腺上皮细胞模型,检测格氏乳球菌的黏附率、侵袭率;通过扫描电镜和透射电镜来研究格氏乳球菌对奶牛乳腺上皮细胞造成的超微结构变化;分别通过建立格氏乳球菌强、弱毒株LG47的MAC-T细胞感染模型,使用不同药物对强毒株LG41感染MAC-T细胞模型进行治疗,以及对强毒株LG41感染MAC-T细胞模型进行NLRP3干扰,研究NF-κB、p-NF-κB、NLRP3、T-GSDMD、N-GSDMD和IL-1β蛋白表达量变化,研究格氏乳球菌导致乳腺炎症的可能机制。结果:共分离49株格氏乳球菌,样品间占比3.40%,16S r RNA基因结果显示全部格氏乳球菌菌株之间遗传距离较近,且与外群关系远;生化结果显示格氏乳球菌具有较高的表型多样性,抗生素最小抑菌浓度显示其对青霉素、氨苄西林、头孢噻呋、头孢喹肟和马波沙星敏感,但12.24%菌株对头孢氨苄耐药,100%菌株对林可霉素和利福昔明耐药;格氏乳球菌乳房炎细菌学治愈率为32.26%低于其他病原菌,治疗后牛奶中体细胞数为132.1万个/m L高于非格氏乳球菌,格氏乳球菌乳房炎奶牛乳头评分粗糙或极粗糙比例为67.74%,乳头评分较差的奶牛更易发生格氏乳球菌乳房炎。通过LDH释放量筛选出格氏乳球菌强毒株1株(LG41,分离自宁夏)、弱毒株(LG47,分离自云南)及与强毒株LG41同一牧场的较弱毒株(LG5);LG41与其他常见革兰氏阳性菌核酸共线性较低,LG5与LG41的亲缘关系比LG47与LG41的亲缘性更近;奶牛乳房炎源格氏乳球菌含毒力基因包括黏附相关、溶血相关、荚膜形成相关、逃避宿主免疫反应相关和其他基因共23个。格氏乳球菌强毒株LG41在小鼠乳腺内保持10~5CFU/g的浓度且炎症反应强烈,而弱毒株LG47引起小鼠乳腺炎症反应轻微;小鼠转录组结果显示成功建立格氏乳球菌乳腺感染模型,格氏乳球菌感染小鼠导致TLR2/NLRP3/NF-κB信号通路相关基因上调;使用1mg/kg头孢噻呋或0.5 mg/kg美洛昔康对格氏乳球菌强毒株LG41感染导致的乳腺炎均有治疗效果。格氏乳球菌强毒株LG41具有LXH254小鼠较强的黏附能力和侵袭能力,破坏MAC-T细胞形态和结构;弱毒株LG47的黏附力和侵袭力均较弱;格氏乳球菌通过TLR2/NLRP3/NF-κB信号通路,引起p-NF-κB、NLRP3、N-GSDMD及IL-1β升高,强毒株LG41比弱毒株LG47引起的上述变化更显著;头孢噻呋和美洛昔康均能降低格氏乳球菌强毒株LG41感染导致的p-NF-κB、NLRP3、N-GSDMD及IL-1β表达上调水平;干扰NLRP3可以降低格氏乳球菌感染导致p-NF-κB、NLRP3、N-GSDMD及IL-1β蛋白表达量的升高,表明格氏乳球菌可以通过TLR2/NLRP3/NF-κB信号通路引起乳腺组织炎性损伤。结论:1成功在国内多地奶牛乳房炎奶样中分离和鉴定出格氏乳球菌,分离率达3.40%,该菌具有生化表型和药物敏感性表型多样性,且该菌感染奶牛乳腺导致临床乳房炎严重影响奶牛健康和牛奶品质。2检测出不同格氏乳球菌分离株毒力基因,主要包括黏附、溶血、免疫逃避相关和其他毒力基因共23个。3格氏乳球菌性小鼠乳腺炎模型中,该菌导致小鼠乳腺组织炎性细胞浸润,腺泡结构破坏,使用1 mg/kg头孢噻呋或0.5 mg/kg美洛昔康均有较好治疗效果。4格氏乳球菌可以破坏奶牛乳腺上皮细胞的正常结构,可以激活TLR2/NLRP3/NF-κB等蛋白和相关通路引起乳腺上皮细胞的炎性应答。干扰NLRP3可以降低格氏乳球菌对奶牛乳腺上皮细胞的致炎效果。