多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是一种由浆细胞(Plasma cell,PC)恶性克隆性增殖导致的常见血液系统恶性肿瘤。目前,MM难以治愈,严重威胁人民生命健康,易误诊或漏诊,导致病情延误。复杂的基因表达变化和染色体不稳定,以及肿瘤细胞与骨髓免疫微环境之间的相互作用,可能共同促进MM进程和耐药。因此,认识MM肿瘤细胞的生物学特性,阐明MM发生、发展相关的生物学机制,发GSI-IX供应商现有效的生物标志物和潜在的药物靶点,有利于MM的精准诊治。本文首先利用单细胞转录组测序(ScRNA-seq)技术从转录组角度研究MM的致癌基因和潜在免疫治疗靶点,再利用二代测序(NGS)技术从基因组角度分析MM的基因突变谱,最后分析MM的临床免疫学指标和构建患MM风险预测模型,为疾病的诊治提供参考。主要研究内容如下:1.基于ScRNA-seq研究MM标志物和潜在免疫治疗靶点。现有研究较少对MM骨髓内细胞总群体的行为改变进行集中分析,探索它们在MM发展中的作用。本研究利用ScRNA-seq技术结合体外试验方案,对MM的不同修订后的国际分期系统(Revised International Staging System,R-ISS)分期患者骨髓样本进行了分析。本研究新发现了一个NKG7表达阳性的细胞毒性PC群,明显富集于MM-II期患者。恶性PC群的MKI67和PCNA表达显著升高,与预后不良和Epstein-Barr病毒感染有关。本文发现并验证了核糖核酸还原酶调控亚单位M2(RRM2)能促进MM细胞的增殖,表明RRM2可能作为MM的一个致病标志物。CD8~+T细胞和NK/T细胞的百分比随着R-ISS分期而下降,提示MM免疫微环境的可塑性。CD8~+T细胞和NK/T细胞与髓细胞及PC的对话确定了几个潜在的免疫治疗靶点,如SIRPA-CD47和MIF-CD74。这些结果提示,RRM2可能作为MM的致病标志物。此外,恶性程度更高的细胞群体可能在推进MM的发展中扮演着更重要的角色。骨髓免疫微环境可能是影响MM细胞群进化的关键因素。2.基于NGS研究MM的骨髓PC基因突变谱。细胞行为的改变追根溯源是基因和蛋白的表达变化所致。为了探索PC群体发生改变的根本遗传因素,本文利用NGS技术对50名MM患者骨髓PC进行了靶向外显子测序,分析其基因突变情况。在MM中发现了337个基因突变,突变类型包括SNP、INS和DEL,其中最主要的突变类型是SNP。对GSE6477数据集的分析则确定了总共660个下调的基因和587个上调的基因。本实验发现的MM突变基因和GSE6477数据集的DEGs存在33个共有的基因。部分基因突变与IL-10、β_2M等临床免疫指标密切相关。进一步的分析显示这些突变基因的功能和通路富集在髓细胞分化、造血调节等方面。此外,我们发现BCL6、BIRC3、HLA-DQA1和VCAN的低表达与MM的预后不购买MC3良相关。经分析发现BCL6、BIRC3和HLA-DQA1的表达与骨髓调节T细胞的浸润呈现负相关,而BCL、VCAN和HLA-DQA1的表达与中性粒细胞的水平呈正相关。ScRNA-seq和NGS筛选的标志物通过基因相互作用分析发现RRM2和VCAN可能通过TP53联系,RRM2和BCL6可能通过GLRX联系。上述结果提示,BCL6、BIRC3、HLA-DQA1和VCAN的突变和低表达与MM的预后不良和免疫细胞浸润有关,ScRNA-seq和NGS筛选的标志物可能共同影响MM免疫状态。3.MM的临床免疫学指标分析和患MM风险预测模型构建。前述ScRNA-seq及NGS分析均提示MM的发展与患者的免疫微环境相关。因此,全面分析MM现有的临床免疫指标,可能发现MM患者特有的免疫行为模式。本部分收集MM与其他恶性浆细胞病和B细胞型淋巴瘤(B cell lymphoma,BCL)患者Porta hepatis的临床免疫指标进行研究。分析发现M蛋白在MM和BCL中的阳性率分别为94.1%、74.9%。FLCκ及FLCλ水平在各恶性浆细胞病和BCL组均可见异常,但在MM中总体水平最高,且FLCκ/FLCλ异常比例最高。IL-10、β_2M在这些疾病间存在显著性差异,可能与NGS分析发现的基因突变有关系。流式细胞术分析显示骨髓B细胞数量在各疾病组间存在显著差异,在MM中含量显著低于意义未明的单克隆免疫球蛋白病及BCL。CD4~+T与CD8~+T的中位数以及CD4~+T/CD8~+T比率在MGUS、MM及BCL之间均有所降低,说明这些疾病都存在T细胞亚型分布的异常,与ScRNA-seq分析得出的T细胞相关结论一致。这些结果提示MM的免疫功能状态与其它恶性浆细胞病和BCL存在一定的差异,有待进一步分析导致相关免疫指标差异的原因。本文基于IL-10、β_2M等临床免疫指标建立了患MM风险预测单中心模型,其预测模型的性能良好,该研究为MM诊断和治疗奠定了一定的基础。综上,本文利用ScRNA-seq技术和NGS技术筛选了MM的标志物,并通过临床样本和体外试验探索了这些标志物在MM中可能的作用机制。本研究发现免疫微环境的改变可能与MM的发展密切相关,进一步的临床免疫指标分析提示MM的免疫功能状态与其它恶性浆细胞病存在一定的差异。基于免疫指标构建患MM风险预测单中心模型的性能良好,为MM诊疗提供基础。本研究的结果可为MM的进一步诊疗、预后研究提供新思路。