目的:探究血管肉瘤干细胞样细胞(Sphere细胞)来源的外泌体通过递送HSP90α至血管肉瘤细胞(ISOHAS细胞)抑制细胞自噬依赖性铁死亡促进肿瘤进展的机制研究,明确HSP90α影响ISOHAS细胞自噬依赖性铁死亡的分子机制。方法:(1)使用外泌体提取试剂盒从细胞培养上清液中提取、分离外泌体,透射电镜鉴定提取外泌体的形态、大小。Western blot检测外泌体标记CD63、CD81的表达及其携带HSP90α的水平。(2)将ISOHAS细胞及Sphere细胞来源的外泌体与ISOHAS细胞孵育24h后,Western blot检测HSP90α表达及铁死亡关键分子SLC7A11、GPX4的表达;试剂盒检测ISOHAS细胞内铁死亡指标Fe~(2+)、MDA、GSH水平变化。(3)GV141-HSP90α与siRNA-HSP90α分别对ISOHAS细胞中的HSP90α进行过表达和沉默,Western blot检测SLC7A11、GPX4的表达;试剂盒检测Fe~(2+)、MDA、GSH水平变化。(4)铁死亡诱导剂Erastin处理ISOHAS细胞,划痕实验及Transwell实验检测Erastin对细胞迁移的影响;Western blot检测SLC7A11、GPX4的表达以及自噬相关分子P62、LC3的表达;Erastin处理外泌体孵育及过表达HSP90α后的ISOHAS细胞;Western blot检测GPX4的表达;试剂盒检测Fe~(2+)、MDA、GSH水平变化。(5)Ferr db V2数据库探究mTOR影响铁死亡的分子机制。(6)mTOR抑制剂RAPA处理ISOHAS细胞后,划痕实验及Transwell实验检测RAPA对迁移的影响;MDC染色及AO染色观察自噬囊泡形成情况;Western blot检测SLC7A11、GPX4、mTOR、P62、LC3的表达;RAPA处理外泌体孵育及过表达HSP90α后的ISOHAS细胞,Western blot检测GPX4的表达;试剂盒检测Fe~(2+)、MDA、GSH水平变化。(7)自噬抑制剂3-MA处理ISOHAS细胞后,划痕实验及Transwell实验检测3-MA对迁移的影响;MDC染色及AO染色观察自噬囊泡形成情况;Western blot检测SLC7A11、GPX4、P62、LC3的表达;3-MA处理诱导铁死亡后的ISOHAS细胞,CCK8检测细胞活性变化,Western blot检测GPX4的表达;3-MA处理沉默HSP90α后的ISOHAS细胞,Western blot检测GPX4的表达;试剂盒检测Fe~(2+)、MDA、GSH水平变化。结果:(1)ISOHAS细胞及Sphere细胞来源的外泌体可上调ISOHAS细胞中HSP90α、GPX4的表达;外泌体通过抑制MDA,Fe~(2+)的蓄积及GSH的消耗抑制ISOHAS细胞铁死亡的发生;相较于ISOHA细胞来源的外泌体,Sphere细胞来源的外泌体对铁死亡的抑制更为显著;(2)过表达HSP90α后,上调GPX4的表达;抑制MDA,Fe~(2+)的蓄积及GSH的消耗,提示HSP90α通过激活GPX4抑制ISOHAS细胞铁死亡的发生。沉默HSP90α后,抑制GPX4的表达;iatrogenic immunosuppression促进MDA,Fe~(2+)的蓄积及GSH的消耗,提示HSP90α通过抑制GPX4激活ISOHAS细胞铁死亡的发生;(3)Erastin降低ISOHAS细胞中SLC7A11、GPX4的表达;Erastin还可逆转被抑制的MDA,Fe~(2+)蓄积及GSH消耗,同时增加ISOHAS细胞铁死亡、抑制其迁移能力。提示Erastin可以重新诱发被外泌体以及过表达HSP90α抑制的铁死亡。Erastin处理ISOHAS细胞后,升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值,提示Erastin在诱发ISOHAS细胞铁死亡的同时激活其自噬;(4)Ferr db V2数据库结果提示mTOR可以通过干预GPX4表达抑制铁死亡;(5)RAPA处理ISOHAS细胞后,MDC、AO荧光染色结果提示自MDV3100分子量噬小体数量增多;同时还可抑制mTOR、P62、GPX4的表达,升高LC3Ⅱ/Lorlatinib使用方法LC3Ⅰ的比值,增加MDA,Fe~(2+)的蓄积及GSH的消耗,同时抑制ISOHAS细胞迁移,结果提示RAPA激活ISOHAS细胞自噬的同时,通过抑制mTOR、GPX4的表达进而激活ISOHAS细胞铁死亡,铁死亡具有自噬依赖性。RAPA可以重新降低被外泌体以及过表达HSP90α升高的GPX4的表达;逆转被抑制的MDA,Fe~(2+)蓄积及GSH消耗。提示RAPA可以重新诱发被外泌体以及过表达HSP90α抑制的铁死亡,外泌体及过表达HSP90α对铁死亡的抑制具有自噬依赖性;(6)3-MA处理ISOHAS细胞后,MDC、AO荧光染色结果提示自噬小体数量减少;3-MA处理可上调P62、GPX4的表达,降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值,同时抑制MDA,Fe~(2+)的蓄积及GSH的消耗,促进ISOHAS细胞迁移。Erastin与3-MA共同处理ISOHAS细胞后,3-MA可以显著抑制Erastin造成的细胞死亡;3-MA可以重新升高被Erastin抑制的GPX4的表达。3-MA可以重新上调被沉默HSP90α抑制的GPX4表达;逆转被促进的MDA,Fe~(2+)蓄积及GSH消耗。提示3-MA抑制ISOHAS细胞自噬的同时,通过上调GPX4的表达进而抑制ISOHAS细胞铁死亡,3-MA可以重新抑制被沉默HSP90α激活的铁死亡,沉默HSP90α对铁死亡的激活具有自噬依赖性。结论:(1)血管肉瘤干细胞样细胞来源的外泌体通过上调血管肉瘤细胞内HSP90α抑制血管肉瘤细胞自噬依赖性铁死亡。(2)HSP90α可能通过激活mTOR-GPX4信号轴抑制自噬依赖性铁死亡。(3)铁死亡诱导剂Erastin可能诱导血管肉瘤细胞发生自噬。