目的:为探讨清热解毒类方剂复方银花解毒汤(FFYH)抗流感病毒的药效作用及机制,本论文首先采用体内外药效评价模型对FFYH抗H3N2流感病毒的药效作用进行了评价;然后利用网络药理学方法对FFYH抗流感病毒的药效作用机制进行初步探讨,并在此基础上对FFYH调控单核细胞固有免疫和自噬Y-27632抑制流感病毒复制及过激免疫反应的作用机理进行了深入探讨,以期为诠释清热解毒类代表性方剂临床治疗呼吸道病毒感染的作用机制奠定理论基础。方法:(1)以H3N2流感病毒感染MDCK与A549细胞为体外模型,首先采用细胞病变试验和血凝试验探究FFYH抑制H3N2流感病毒复制的作用,然后通过qRT-PCR、Western blot和免疫荧光等方法确证FFYH抑制H3N2流感病毒复制的作用机制;在此基础上以H3N2流感病毒感染小鼠为体内模型,以饮食量、体重变化、生存期、肺指数、死亡保护率、血清炎症因子水平及肺组织病变为考察指标,进一步探究FFYH体内抗H3N2流感病毒的药效作用;最后,通过多细胞因子芯片检测分析FFYH对H3N2流感病毒感染所致过激炎症因子风暴的抑制效应;(2)以FFYH单味中药活性成分与复方中药关键活性化合物为研究对象,通过TCMSP和Pubchem数据库检索并筛选出有效的药理成分及对应的靶点,然后利用网络分析软件构建“中药/化合物-靶点-疾病”、PPI、GO及KEGG网络分析图,对潜在的药物靶点及相关信号通路进行系统性的对比分析,并利用分子对接技术加以验证,进一步深入探究FFYH抗IAV的作用靶点及相关信号通路;(3)基于H3N2流感病毒感染所致单核细胞炎症因子显著增加的特点以及网络药理学的结果,以THP-1单核细胞为病毒感染模型,采用qRT-PCR及Western blot法探究FFYH抑制流感病毒复制与过激炎症反应的作用及机制,然后以流感病毒感染小鼠为体内模型再次确证FFYH调控宿主免疫抑制病毒复制与过激炎症反应的双重机制;(4)基于前期网络药理学研究发现FFYH抗流感病毒药效作用与自噬相关通路有关,利用H3N2流感病毒感染诱导A549和THP-1细胞自噬为体外模型,采用qRT-PCR和Western blot法探究FFYH对H3N2流感病毒感染诱导A549和THP-1单核细胞自噬的影响,然后通过采用药理学方法阻断细胞自噬形成进一步探究阻断自噬对FFYH抑制H3N2流感病毒复制的影响,最后以稳定表达mCherry-EGFP-LC3B细胞为模型,利用激光共聚焦考察FFYH对流感病毒诱导细胞自噬潮的影响。结果:(1)体内外药效研究结果表明,FFYH在MDCK和A549细胞模型中不仅可以剂量依赖性地抑制新生病毒的产生、RNA转录和蛋白表达,而且在H3N2流感病毒感染小鼠模型中能有效延长小鼠的生存时间,显著降低小鼠的死亡率,改善外周血炎症因子水平和肺组织病理损伤,从而提高小鼠的生存率,具有良好的抗H3N2流感病毒作用。(2)网络药理学研究表明,FFYH单味中药活性成分和复方关键活性成分共同的核心靶标主要包括MAPK1、SRC、HSP90AA1、EGFR;关键信号通路主要包括PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路、自噬、mTOR信号通路、Toll样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路,提示FFYH抗IAV的潜在作用机制可能与上述靶点及信号通路有关。(3)通过调控单核细胞免疫研究表明,在THP-1单核细胞中FFYH不仅能剂量依赖性抑制H3N2流感病毒RNA转录与蛋白表达,而且能有效降低IL-6、CXCL-10、IFN-α、NLPR3等促炎因子的水平;机制研究显示FFYH一方面通过靶向抑制THP-1单核细胞中TLR7/MyD88/IRF7炎症信号通路,缓解IAV导致的IL-6、CXCL-10、IFN-α、NLPR3等促炎因子上调,另一方面FFYH通过促进小鼠组织中RIG-I/MDA5-IRF3抗病毒免疫信号medical demography通路,间接促进PRK、Mx1、ISG15、TRIM25等ISGs的表达发挥抑制流感病毒复制,因此靶向TLR7/MyD88/IRF7炎症信号通路和RIG-I/MDA5-IRF3抗病毒免疫信号通路可能是FFYH调控免疫抗H3N2流感病毒性肺炎的关键机制。(4)通过调控自噬机制研究表明,在THP-1和A549细胞中H3N2流感病毒感染均可增强细胞自噬水平,增加LC3B-Ⅱ的表达,促进P62的降解,增强自噬潮的形成;而采用药理学方法阻断自噬NP蛋白表达水平明显降低,自噬标志物LC3B-Ⅱ和P62的聚集显著增加,表明H3N2具有诱导细胞自噬促进自身复制的作用。而FFYH处理后显著抑制病毒NP蛋白的表达,促进LC3B-Ⅱ和P62的聚集,阻断细胞自噬潮,作用效果与抑制剂CQ和BafA1相似,表明FFYH抗H3N2流感病毒作用可能与阻断流感病毒劫持细胞自噬促进自身复制途径有关。此外,FFYH在A549细胞和THP-1细胞中药理学方法阻断自噬形成均能协同增强FFYH抑制病毒NP蛋白的表达,以上结果表明阻断H3N2流感病毒诱导的细胞自噬可能是FFYH发挥抗H3N2流感病毒药效的关键机制。结论:体内外研究结果表明FFYH具有良好的抗H3N2流感病毒作用。机制研究显示FFYH不仅可通过抑制流感病毒RNA转录和蛋白表达直接抑制新生病毒的复制,而且可通过调控单核细胞RIG-I/MDA5-MAVS/IPS-1-IRF3抗病毒固有免疫信号通路和细胞自噬间接S63845体内抑制流感病毒复制,结果表明FFYH可能通过多成分、多靶点、多途径综合发挥抗流感病毒性肺炎的药效作用。