狂犬病(Rabies)又称恐水症,是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的一种致死率高达100%的嗜神经性人兽共患传染病。RABV可感染人和各种温血动物,犬是当前狂犬病传播的主要传染源。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计,每年约有6万人因狂犬病死亡,对全球人类健康和公共卫生安全构成重大威胁。目前,狂犬病尚没有有效治疗方法,疫苗免疫注射是控制该病发生和流行的最主要手段。WHO研究显示,在流行地区70%以上的犬接种疫苗可有效预防狂犬病传播。目前市售狂犬病疫苗均为灭活疫苗,其安全性高,但存在成本高和免疫效果不持久等问题;弱毒疫苗因存在致病的可能性,目前在我国已被禁止生产和使用。因此,研究安全、有效的新型疫苗对于狂犬病的综合防控具有重要意义。复制缺陷型病毒的复制依赖于外源蛋白的补充,在正常宿主细胞中仅发生单轮感染,不能进行复制增殖。相较于野生型病毒,复制缺陷型病毒的生物安全性得到了极大的提高。研究表明复制缺陷型病毒作为疫苗使AZD9291分子式用时,与弱毒疫苗一样可在感染细胞内表达抗原诱导机体产生免疫保护,且具有灭活疫苗一样的安全性。本研究利用Piggy Bac转座子系统构建了表达狂犬病病毒糖蛋白(RABV G)的细胞株;利用狂犬病病毒反向遗传学系统成功构建了缺失G基因的重组狂犬病病毒r SRV9-△G-e GFP,通过小鼠实验评价其安全性和免疫原性,为新型狂犬病疫苗和疫苗载体研究奠定基础。具体研究内容包括:(1)表达RABV G蛋白稳转细胞株的建立与鉴定基于Piggy Bac转座子系统,扩增RABV疫苗株SRV9 G基因并构建重组质粒YHMSRV9-G。将重组质粒与Piggy Bac转座子酶质粒共转染至BSR/T7细胞中,经灭瘟素S盐酸盐(Blasticidin)连续药筛,利用有限稀释法连续单克隆纯化2次后获得单克隆细胞株,并通过PCR、间接免疫荧光、Western Blot及激光共聚焦等技术进行鉴定。结果显示,合适的Blasticidin药筛浓度为20μg/m L;筛选出的稳购买MLN8237转细胞株BSR-G细胞可以稳定表达RABV G蛋白,且RABV G蛋白主要表达在细胞膜上。(2)复制缺陷型G基因缺失重组狂犬病病毒的构建与鉴定基于实验室前期建立的RABV SRV9株反向遗传系统,构建了G基因缺失且表达绿色荧光蛋白(e GFP)基因的重组狂犬病病毒全长感染性克隆p D-SRV9-△G-e GFP。将p DSRV9-△G-eIn Situ Hybridization GFP与表达N、P、G、L四种辅助质粒共转染BSR-G细胞,拯救重组病毒。通过DFA、RT-PCR、透射电镜等进行鉴定,并分析其生物学特性。DFA结果表明成功拯救到重组狂犬病病毒r SRV9-△G-e GFP;RT-PCR结果表明重组病毒基因组不含有RABV G基因,并具有遗传稳定性;透射电镜结果显示重组病毒r SRV9-△G-e GFP仍具有典型的子弹状形态特征;生长曲线表明重组病毒r SRV9-△G-e GFP与母本病毒SRV9的生长动力学趋势相似;传播特性研究表明重组病毒r SRV9-△G-e GFP不能在BSR细胞上增殖,仅在BSR-G细胞有效增殖。(3)复制缺陷型G基因缺失重组狂犬病病毒的实验免疫研究为了评估重组病毒r SRV9-△G-e GFP的安全性,将重组病毒r SRV9-△G-e GFP与母本病毒SRV9通过脑内注射感染5日龄ICR乳鼠,观察并记录乳鼠的精神状况、体重变化及死亡情况,连续观察14天。结果显示,SRV9组小鼠在病毒感染后4 d开始出现精神沉郁、瘫痪和死亡等临床症状,并在感染后11 d全部死亡;r SRV9-△G-e GFP感染小鼠未出现发病症状,且全部存活。为了评估重组病毒r SRV9-△G-e GFP的免疫原性,将重组病毒r SRV9-△G-e GFP、灭活母本病毒以及母本病毒通过肌肉注射免疫小鼠,检测小鼠细胞免疫和体液免疫应答。结果显示,重组病毒r SRV9-△G-e GFP首次免疫后在小鼠腹股沟淋巴结细胞中检测到DC细胞、T细胞和B细胞的活化;三免后一周在脾脏中检测到T细胞、B细胞的活化以及记忆T细胞的产生,分泌IFN-γ和IL-4的脾细胞显著增多;三免后小鼠血清中可检测到RABV中和抗体,并达到国际标准(0.5 IU/m L)。综上,利用狂犬病病毒反向遗传学系统构建了复制缺陷型G基因缺失重组狂犬病病毒r SRV9-△G-e GFP,r SRV9-△G-e GFP仅可在表达RABV G蛋白的稳转细胞株BSR-G中有效增殖,且对5日龄乳鼠无致病性,与母本病毒相比具有更高的安全性;r SRV9-△G-e GFP免疫小鼠后可刺激机体产生狂犬病病毒中和抗体和特异性细胞免疫应答,可作为狂犬病新型基因工程疫苗候选株。