单倍体(Haploid)只含有父本或者母本的一套基因组,在基础研究和现代育种中具有巨大的应用价值。单倍体获得后经基因组加倍只需两代即可得到纯合的双单倍体(DH)株系,可以显著缩短育种进程。单倍体的生产主要分体内和体外两种方法。体外主要通过雌、雄配子体的组织培养再生而获得单倍体,体内主要分为异源花粉诱导和单倍体诱导系诱导两种。使用单倍体诱导系诱导是最为方便快捷的生产单倍体的前沿技术,而基于CENH3的诱导系统是备受关注的两大单倍体诱导系统之一。CENH3是在真核生物中发现的着丝粒特异的组蛋白H3变体,它对着丝粒的形成和功能至关重要。科学家首次发现操纵CENH3功能可以创制单倍体诱导系,单倍体诱导系GFP-tailswap(拟南芥CENH3的N端tailNirogacestat替换为H3.3的N端tail,随后将GFP蛋白融合到该改造后的CENH3蛋白的N端)既可诱导产生父本单倍体,也可诱导产生母本单倍体,具有高度的灵活性。因CENH3功能高度保守,理论上该系统应该也适用于广大其他作物。但是在其他作物中的尝试并没有如预期那样成功,即便已经在玉米、小麦等作物中成功创制了基于CENH3的诱导系,但是这些诱导系的仍具有诱导能力低,花粉活力极为低下等缺点,阻碍了该方法的进一步应用和研究。我们的研究发现,GFP-tailswap花粉活力和单倍体诱导能力对环境温度的变化高度敏感,且环境温度对二者的影响是独立的。基于该发现,我们成功设计了可以通过灵活操纵环境温度从多个角度优化基于CENH3的母本和父本单倍体诱导的策略。我们发现GFP-tailswap的育性对环境温度的变化高度敏感。拟南芥的正常生理温度为16℃-25℃,拟南芥的最适生长温度在22℃。将GFP-tailswap的生长温度降低至18℃,其育性即可恢复到野生型的80%以上。相反,提高3℃的环境温度,GFP-tailswap育性几乎完全丧失。GFP-tailswap诱导系的不育和对环境温度的反应主要体现在雌、雄特别是雄配子的发育上,这与报道CENH3的功能缺失造INCB28060体内实验剂量成减数分裂时染色体的分离障碍一致。因此GFP-tailswap是一个温度敏感型的核雄/雌性不育株系。res1完全不能恢复GFP-tailswap的花粉活力和育性,证明低温恢复GFP-tailswap花粉活力可能不同于已报道的通过减缓配子体的发育的恢复机理。除育性外,我们也发现GFP-tailswap也对环境温度高度敏感,其单倍体诱导能力从18℃的约20%大幅度升高至25℃的80%左右。我们进一步证明对环境温度的敏感性是基于CENH3的单倍体诱导系的普遍现象。我们使用CRISPR技术创制的一个弱突变cenh3-8,在低温和正常条件下没有任何单倍体诱导能力,tethered membranes但是在25℃条件就体现了可观的单倍体诱导能力(13.6%)。此外通过转换授粉前后的环境温度,我们发现温度对诱导能力的影响独立于对配子体发育的影响。基于我们的发现,针对父本单倍体和母本单倍体的诱导,我们设计了不同的操纵温度的策略,但都从简化诱导过程和提高诱导效率两个方面进行了显著的优化。对于父本单倍体诱导来说,可以直接在25℃条件下进行,因为该条件下,将近一半的雌配子仍发育正常,但雄配子完全不育,故不需要去雄的步骤,且诱导效率也提高到77%以上。而对于母本单倍体诱导,首先使用低温的条件恢复诱导系的活力,之后使用活力恢复的诱导系花粉授粉目标植物,将GFPtailswap的母本单倍体诱导提升到创纪录的24.8%以上。高效的单倍体诱导系在基础研究和种业应用中都极具价值。我们使用优化后的单倍体诱导策略成功创制了一个多用途的永久DH群体,该群体基于在DNA序列和表观修饰(DNA甲基化)上都有着显著的多态性。群体内的成员在种子大小、花期、休眠等多个方面都发生非常明显的表型分离现象。因此该群体可用于多种表型的常规QTL以及epi QTL位点的研究和基因克隆,该群体还可用于研究遗传位点与表观遗传位点的互作这些重要问题。综上所述,我们发现环境温度是影响基于CENH3的单倍体诱导系的关键因素。且通过灵活改变环境温度可以在诱导难易度和诱导效率两个方面优化母本和父本单倍体的生产。由于CENH3的功能在各物种中的保守性,我们的研究结果为在更为广泛的作物中应用该体系提供了清晰的线索。