食品中的丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是富含碳水化合物的食物在高温加工过程中形成的有毒有害物质。ACR对人体有不容忽视的危害,包括肝毒性,神经毒性和致癌性。槲皮素(Quercetin,QCT)是人们在日常饮食中摄入量最大的类黄酮之一,存在于多种水果和蔬菜中。QCT具有良好的抗氧化能力,能够抵抗很多化学因素诱导的机体损伤和炎症。本课题以ACR和QCT为研究对象,通过建立体内动物模型以及结合体外细胞实验探究QCT对ACR诱导的肝损伤的影响,使用转录组测序技术(RNA-seq)并进行生物信息学分析来预测其潜在的作用机制。同时,进一步利用LC3双荧光质粒转染和蛋白质印迹法检测QCT处理对ACR暴露的Hep G2细胞自噬的影响。最后基于蛋白质溶酶体共定位和蛋白质-配体对接实验,进一步探讨QCT通过抑制铁死亡(Ferroptosis)进而缓解ACR肝毒性的分子机制。主要研究结论如下:(1)QCT在体内体外都显著减弱ACR诱导的肝毒性。通过对小鼠肝脏切片进行的hematoxylin-eosin(HE)染色分析和对血清aspartate aminotransferase(AST)、alanine aminotransf获悉更多erase(ALT)指标的检测,我们发现QCT在小鼠体内可以显著缓解ACR诱导的肝损伤。同时,采用CCK-8法检测ACR对Hep G2细胞活力的影响。结果显示ACR呈剂量依赖性地抑制了Hep G2细胞活力(IC50为5MDV3100试剂 m M)。而10μM QCT能够有效缓解5 m M ACR造成的细胞活力下降。(2)QCT通过抑制铁死亡减轻ACR诱secondary infection导的肝损伤。RNA-Seq和进一步的生物信息学分析表明QCT下调了ACR激活的氧化应激、自噬和铁死亡信号通路。同时,ACR在C57BL/6J小鼠和Hep G2肝细胞中表现出与铁死亡诱导剂Erastin相似的毒性迹象:谷胱甘肽(GSH)含量下降而丙二醛(MDA)含量上升,铁死亡标志物GPX4蛋白水平下降,COX-2蛋白水平和脂质过氧化物含量上升。另外,QCT和特异性铁死亡抑制剂Fer-1都可以有效减轻ACR或Erastin引起的铁死亡。这些结果表明QCT可以在体内和体外有效地抑制ACR诱导铁死亡从而发挥护肝作用。(3)QCT通过抑制氧化应激(Oxidative stress)以缓解ACR诱导的铁死亡。通过使用活性氧(ROS)检测试剂Dihydroethidium(DHE)对小鼠肝组织和Hep G2细胞进行检测,我们发现ACR显著诱导了ROS的累积。利用ROS清除剂NAC作为抑制剂并使用线粒体膜电位(MMP)染料JC-1对细胞进行检测,进一步证实了ACR通过诱导MMP下降、ROS累积而造成氧化应激。另外我们还发现ACR能够显著诱导NRF2蛋白的表达。而与NAC的效果类似,QCT能显著减轻ACR在Hep G2细胞中诱导的氧化应激。有趣的是,在NAC的作用下,ACR诱导的氧化应激被减弱的同时铁死亡也被抑制。综上所述,QCT能通过抑制ACR诱导的氧化应激从而减轻铁死亡。(4)QCT通过抑制氧化应激驱动的自噬以缓解ACR诱导的铁死亡。我们在ACR暴露小鼠肝脏切片中观察到了自噬标志蛋白LC3B表达的上升。同时,基于EGFP-RFP-LC3双荧光转染和蛋白质印迹实验,我们进一步发现ACR诱导了Hep G2细胞过度自噬。而自噬特异性抑制剂CQ能显著降低ACR诱导的自噬从而抑制铁死亡,这表明ACR诱导的铁死亡依赖于自噬。同时,QCT与NAC能通过减少氧化应激而抑制ACR诱导的自噬,说明ACR诱导的自噬由氧化应激驱动。综合而言,QCT通过抑制ACR诱导的氧化应激,从而抑制过度自噬并缓解铁死亡。(5)QCT通过减少自噬依赖性铁离子(Fe~(2+))累积以抑制铁死亡。铁死亡的发生依赖于细胞内增加的游离铁所产生的过量脂质过氧化物。我们发现QCT和自噬抑制剂CQ、铁螯合剂DFO都显著减少了ACR诱导的游离铁累积并抑制了铁死亡。基于蛋白质免疫印迹和蛋白质-配体对接技术,研究进一步发现QCT可能与自噬货物受体蛋白NCOA4发生特异性反应,从而阻断铁重链蛋白FTH1的降解以减少细胞内游离铁含量,并最终缓解ACR诱导的铁死亡。综上所述,本研究旨在利用动物模型和细胞实验探讨QCT对ACR所致肝损伤的缓解作用及其机制。本研究揭示了QCT能够缓解ACR诱导的氧化应激、过度自噬和游离铁累积。更重要的是,QCT逆转了GSH的消耗并显著降低了过量脂质过氧化物的产生,有效地抑制了ACR诱导的铁死亡。我们的实验结果提供了证明QCT可以通过NCOA4/FTH1信号通路抑制自噬依赖性铁死亡,从而建立对ACR诱导肝损伤保护作用的新证据。这些结果可能为利用植物天然抗氧化剂缓解ACR诱导的肝损伤提供新思路,为开发聚焦于抑制铁死亡以缓解食品污染物毒性的膳食补充剂提供创新性策略。