基于生物信息学研究Vimentin与肝细胞癌的关系及健脾益气方通过Vimentin调控肝癌分子机制的实验验证

目的:研究波形蛋白(Vimentin)与肝细胞癌(HCC)的关系及健脾益气方通过Vimentin调控肝癌的分子机制。方法:利用基于TCGA和CPTAC数据的在线分析平台、STRING数据库及Cytoscape软件分析Vimentin与肝细胞癌的关系。随机将SD大鼠分为正常组,模型组,健脾益气方低、中、高剂量组(5.25、10.5、21 g·kg~(-1)),信号转导蛋白及转录激活子3(STAT3)抑制组(C188-9,4.5 mg·kg~(-1))和糖蛋白130(gp130)抑制组(SC144,4.5 mg·kg~(-1)),每组10只。除正常组外,其余各组大鼠按照70 mg·kg~(-1)体质量腹腔注射二乙基亚硝胺(DEN)复制肝癌模型。造模成功后,正常组和模型组大鼠生理盐水灌胃,健脾益气方低、中、高剂量组分别给予对应剂量中药灌胃,两个抑制组分别腹腔注射对应抑制剂,每日1次,连续4周。末次处置后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)方法检测大鼠肝组织中VIM mRNA水平;比色法检测肝组织胱天蛋白酶-3(Caspase-3)酶活性;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝组织中Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)、Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)、aurora 激酶B(AURKB)、锌指蛋白148FUT-175临床试验(ZNF148或者ZBP-89)、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、总Vimentin、磷酸化Vimentin(p-Vimentin)以及肝组织细胞核中Vimentin蛋白含量;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测大鼠血清中Vimentin的含量。结果:VIM mRNA在肝癌患者不同病理分期(I-Ⅳ期)、不同病理分级(G1-G3级)、无区域淋巴结转移患者(N0)和肝癌不同亚型患者组织中表达水平均显著升高(P<0.01);Vimentin蛋白水平在肝癌组织中显著降低(P<0.01);VIM mRNA高表达/低表达对HCC患者总体生存期(OS)、无病生存期(DFS)的影响差异无统计学意义(P>0.05);VIM基因有4处突变可以导致Vimentin蛋白一级结构的改变,这些遗传突变可降低患者DFS(P<0.001);VIM mRNA的表达水平与HCC纯度呈负相关(P<0.001),而与微环境中肿瘤相关成纤维细胞、M2型巨噬细胞和髓系树突状细胞等的浸润水平呈正相关(P<0.001)。关联分析结果显示VimentinChromatography与STAT3在HCC患者肝癌组织中的表达存在一定相关性(P<0.0001)。动物实验结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肝组织中VIM mRNA、总Vimentin、p-Vimentin和核Vimentin蛋白水平、血清中分泌型Vimentin水平、肝组织中ROCK2、AURKB、STAT3和p-STAT3蛋白水平均显著上调(P<0.01);负调控分子ZBP-89蛋白水平显著降低(P<0.01);Caspase-3酶活性升高、ROCK1蛋白表达水平增加,但是差异无统计学意义(P>0.05)。STAT3抑制剂和gp130抑制剂以及中、高剂量健脾益气方均可显著降低大鼠血清中分泌型Vimentin水平,肝组织中总Vimentin、p-Vimentin和核Vimentin蛋白水平,及STAT3/Vimentin信号通路主要相关分子STAT3、p-STAT3、ROCK2、AURKB的蛋白水平,上调负调控分子ZBP-89蛋白水平和Caspase-3酶活性(P<0.05或P<0.01),且中剂量或高剂量健脾益气方对VIM mRNA水平、STAT3蛋白、ZBP-89蛋白、ROCK2蛋白和AURKB蛋白水平,及CasGDC-0973pase-3酶活性的干预结果,与STAT3抑制剂相比差异均不具有统计学意义(P>0.05)。结论:Vimentin是肝癌组织中一种重要的炎症分子,其表达、细胞定位和功能可能受肿瘤相关成纤维细胞、M2型巨噬细胞和髓系树突状细胞浸润水平,及IL-6/STAT3信号、特别是STAT3分子的影响;而健脾益气方可能通过干预STAT3/Vimentin信号通路调控Vimentin而防治肝癌。