牛呼吸道合胞病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)是一种有包膜、单股、负链的RNA病毒。它是副黏病毒科、肺炎病毒亚科、肺病毒属的成员,是奶牛和肉牛犊牛呼吸道疾病复合体(BRDC)的主要病原之一。BRSV可通过直接接触或气溶胶传播,从而引起严重的呼吸系统疾病,临床表现为发热、鼻涕、咳嗽,严重时会引起死亡。目前,BRSV的诊断方法主要有血凝抑制试验(HI)、中和试验(NT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(q RT-PCR)等。其中,ELISA方法具有简单、快速、灵敏等优势,但是国内尚无商品化ELISA试剂盒,而进口ELISA试剂盒价格昂贵,严重阻碍了我国对BRSV的防控工作。因此建立检测BRSV的ELISA方法,对该病的流行病学调查、监测以及防控具有重要意义。而BRSV的N蛋白是所有蛋白中非常重要的一个结构蛋白,具有良好的免疫原性。本研究利用BRSV的N基因physiological stress biomarkers序列构建了杆状病毒表达载体,通过表达的N蛋白来建立检测BRSV的间接ELISA方法。本研究根据Gen Bank上BRSV参考序列(登录号:NC001989.1)N基因此网站序列,设计出一Trichostatin A生产商对完整扩增N基因序列的引物,并分别在其5’引入Bam HⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点。通过PCR将N基因序列扩增并进行双酶切,用T4连接酶将N基因序列与转移载体p Fast Bac-HTB连接,再通过DH10Bac感受态大肠杆菌转座至杆状病毒载体上,最后通过转染Sf9昆虫细胞,构建了可以稳定表达重组蛋白的重组杆状病毒Bacmid-BRSV-N。通过SDS-PAGE和Western-blot分析表示,重组蛋白以分泌在上清的形式表达,用培养基上清进行His-Ni亲和层析法进行蛋白的纯化,利用BRSV阳性血清作为一抗与重组蛋白进行Western-blot反应。结果显示重组BRSV N蛋白可以与BRSV阳性血清发生特异性反应。利用纯化的重组BRSV N蛋白作为包被抗原,BRSV阳性血清作为一抗,建立间接ELISA诊断方法。通过一系列的优化,最终确定间接ELISA的最佳反应条件:抗原包被浓度为8μg/m L、4℃过夜包被、待检血清稀释800倍、5%脱脂奶粉封闭1h、抗原和一抗(待检血清)反应时间2h、HRP标记二抗稀释5000倍、反应1.5h、TMB显色20min。以优化后的方法检测30份BRSV阴性血清计算临界值,确定当血清的OD_(450)大于0.215时为阳性,OD_(450)小于0.178时为阴性,样品的OD_(450)位于阴性和阳性临界值之间的,认为其可疑,需要重新进行检测。经测试,本实验所建立间接ELISA方法对牛传染性鼻气管炎病毒(IBR)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)阳性血清进行检测后,其检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。牛源BRSV阳性血清按1280倍稀释时,检测结果依旧为阳性,证明该方法具有良好的敏感性。同时批内重复性实验和批间重复性实验的结果,变异系数均在10%之内,证明该方法也具有良好的重复性。利用建立的ELISA检测方法和商品化ELISA检测试剂盒和对吉林省部分牛场200份牛源血清进行检测,两者的符合率为88.5%,同时发现吉林省部分牛场的BRSV抗体阳性率超过30%。综上所述,本研究成功建立了检测BRSV的间接ELISA方法,并证明建立的间接ELISA方法可以进行样品的检测,为BRSV的检测工作提供依据。