目的:了解幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株是否存在阿莫西林(Amoxicillin,AMX)持留菌;了解抗生素持留性在Hp耐药演化中的作用;探究Hp AMX不稳定耐药表型演化为稳定耐药表型的可能机制。方法:1.Hp AMX持留菌株的筛选和验证用改良琼脂稀释法(Modified Agar Dilution Method,MADM)从临床分离的Hp中筛选AMX持留菌,通过检测时间-杀菌曲线来确定其持留性。2.持留性在Hp对AMX耐药演化LGK-974纯度中的作用分别以相同AMX最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)的持留菌H443和敏感菌H568为亲本菌株,经体外11次不断增加浓度的AMX接触后,再次检测AMX的MIC。对获得的耐药克隆H443R与亲本菌株H443进行全基因组和转录组测序,并且通过vac A,atp D,hop B,hop C,met Q的RT-q PCR和检测细菌细胞内的ATP的含量验证转录组测序的结果,分析H443R菌株耐药性增Stroke genetics加的原因。3.Hp AMX稳定高水平耐药表型的演化及其基因突变的检测和分析以Hp经-80℃冻存后对AMX的MIC不同程度下降(不稳定耐药)的4株Hp菌株作为出发菌株,在不断增加AMX浓度的培养基上传代20～55代,筛选AMX稳定的高水平耐药克隆,检测耐药克隆的MIC,置于-80℃冻存3个月后再复苏,根据冻存后MIC是否下降判断其耐药性是否稳定。对AMX稳定耐药的克隆H390r和出发菌株H390进行基因组测序和分析。最后用外排泵抑制试验检测H390r和H390在含外排泵抑制剂时对AMX的MIC。结果:1.Hp AMX持留菌株的筛选和验证用MADM从Hp临床菌株中筛选出1株AMX-持留菌(H443),该菌株杀菌曲线具有双峰杀菌特征,证实了H443为持留菌。2.持留性在Hp对AMX耐药演化中的作用以AMX-敏感菌H568为亲本菌株,在含AMX浓度不断增加的琼脂平板上连selleckchem续传11代,第11代获得H568S(MIC 0.016mg/L)克隆,其敏感性与亲本菌株H568相似。然而,与以H568具有相同MIC的AMX-持留菌H443为亲本菌株,在含AMX浓度不断增加的琼脂平板上连续传11代,耐药性快速增加,第11代演化出低水平耐药菌株H443R(MIC 0.5mg/L),其AMX MIC高于亲本菌株的31倍以上。通过基因分析,与亲本菌株H443相比,H443R共有涉及16个基因的28个突变,其中包括与AMX耐药性相关基因pbp1a、fts I、hef C和hof H,基因表达高频可逆ON/OFF开关mod基因的突变。转录组结果显示,H443R与H443在多个KEGG富集途径上存在显著差异,其中H443R下调的基因显著富集于氧化磷酸化(与ATP产生有关)和核糖体,而H443R上调的基因显著富集于鞭毛组装、ABC转运、同源重组和错配修复,其中后两者涉及DNA错配修复程序。通过RT-q PCR验证vac A,atp D,hop B,hop C,met Q基因在H443R的表达均下调,与转录组测序结果一致。H443R细胞内的ATP水平显著低于H443。3.Hp AMX稳定高水平耐药表型的演化及其基因突变的检测和分析对4株AMX不稳定耐药的菌株通过AMX筛选获得4株对AMX稳定高水平耐药(MIC 12～256mg/L)的Hp克隆,分别记为H390r、H443r、H574r、H576r。H390r相比于亲本菌株H390存在多个基因的突变,包括与AMX耐药性相关的基因hef C、hop B、hop C和fts I。在不添加外排泵抑制剂时,H390r对AMX的MIC为≥256mg/L,在添加外排泵抑制剂时其MIC下降至12mg/L。而H390在有无外排泵抑制剂时对AMX的MIC均为0.5mg/L。结论:Hp临床菌株中存在AMX-持留菌;Hp持留性不是耐药性,但其可以通过体外连续的AMX接触较快的演化出AMX的耐药性,涉及的耐药突变基因与临床分离菌株获得的耐药突变基因相似;Hp AMX不稳定耐药表型通过在体外连续的AMX接触能演化出稳定高水平耐药表型,机制主要涉及药物外排。