5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是一种重要的DNA甲基化修饰,与疾病的产生有着重要联系。当前5hmC的定量分析方法中,样品前处理大部分用到了化学试剂。这些方法不仅步骤繁琐,还会对DNA造成一定的损伤。因此,有必要建立操作简便、不使用化学试剂的5Preclinical pathologyhmC定量分析方法。二硫苏糖醇(DTT)是一种巯基保护剂,在生物化学和细胞生物学中有着广泛的应用。当前,DTT的检测分析方法常见的有荧光探针法和液质联用法,但是这些分析方法有的需要耗费大量的有机试剂,有的需要设计合成特定探针,有的步骤繁琐,花费时间较长。因此,建立一种快速、便捷的DTT检测方法非常有必要。本论文的具体研究内容如下:一、基于免化学氧化法和连接-实时定量荧光PCR扩增技术,获悉更多建立了一种步骤简便、特异性好的特定位点5hmC检测方法,实现了对鼠脑DNA中特定位点5hmC百分比含量的检测。该方法分别用T4噬菌体β-葡糖基转移酶(β-GT)和Aba SI限制性内切酶对目标链进行糖基化和酶切处理,使用连接酶连接Hairpin探针和处理后的目标链,之后利用实时定量荧光PCR技术对连接产物进行扩增,实现检测5hmC的目的。该样品处理方法不使用化学试剂,简化了实验步骤,避免了对DNA样品的损伤。用建立的分析方法检测了特定位点5hmC的含量和胞嘧啶的总含量。另外,本文将该方法应用到了鼠脑DNA样品中某一特定位点5hmC的百分比含量的测定。二、基于不对称PCR技术和便携式血糖仪检测5hmC。该方法使用免化学氧化的方法对目标链5hmC进行处理,之后用连接酶连接Hairpin探针和处理后的目标链,使用不对称PCR技术扩增出单链,利用磁珠捕获分离单链产物。之后使用磁珠上的单链产物与蔗糖转化酶修饰的探针进行杂交,利用蔗糖确认细节转化酶将蔗糖转化为葡萄糖。通过便携式血糖仪检测葡萄糖浓度,间接实现对5hmC的便捷检测。该方法不需使用昂贵仪器,成本低。三、线性探针介导的连接-PCR反应检测5hmC。该方法使用免化学氧化的方法对目标链进行处理,用线性探针进行连接反应,结合实时定量荧光PCR技术对连接产物进行扩增,实现5hmC的检测。相较于Hairpin探针,线性探针可以有效降低非特异扩增。四、基于DNA修饰的Au NPs可视化检测DTT。此方法使用单链DNA修饰的金纳米粒子检测DTT。DTT中的双巯基可以破坏单链DNA与金纳米粒子之间的作用力,使得单链DNA释放,体系颜色由红色变为蓝色,裸眼观察体系颜色变化即可实现对DTT的可视化检测。测定特定波长下体系的吸光度,利用吸光度比值与DTT浓度的关系可快速定量检测DTT。此方法不仅步骤简便,耗时少,而且干扰较小。