研究背景酒精在所有体液和组织中具有较强的扩散和分布能力,因此酒精暴露与多个组织中的代谢过程的变化有密切关系。酒精透过血脑屏障进入中枢神经系统(Central nervous system,CNS)后可通过与多种神经递质系统发生相互作用,如多巴胺(Dopamine,DA)、谷氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)和内源性阿片等。长期酒精暴露引起的神经递质系统改变是引起酒精成瘾以及酒精戒断综合症(Alcohol withdrawal syndrome,AWS)的重要原因,长期饮酒后突然戒酒引起的海马中谷氨酸能系统的兴奋能够诱发焦虑、癫痫发作等酒精戒断症状的发生。由于AWS导致的复饮率接近100%,因此缓解酒精戒断引起的消极情感成为了目前临床上主要治疗酒精戒断综合症的手段之一,美金刚作为N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体拮抗剂在治疗AWS方面显示出了良好的前景,但是目前美金刚缓解酒精戒断症状的机制尚不清楚。研究目的本研究通过构建慢性酒精消耗和酒精戒断动物模型,基于靶向代谢组学技术探索酒精暴露和酒精戒断引起的血清中神经递质和氨基酸的改变,同时以美金刚作为治疗药物考察美金刚引起的Glu N1、Glu N2B和谷氨酸转运体-1(Glutamate transporter-1,GLT-1)的改变,探究美金刚对谷氨酸能系统的影响。研究方法采用10只斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠自由饮用20%(w/w)酒精8周构建慢性酒精消耗模型,所有大鼠造模前采集一次静脉血(第0周)作为空白对照,并在饮酒的第1、2、3、4、5、6、7和8周进行采血。选择第0、1、2、4、6、8周的血清样本进行前处理后,基于已开发的广泛靶向代谢组学技术,使用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)对大鼠血清中216个代谢物进行相对定量分析。检测完成后数据导出至Excel中,去除缺失数据比例大于20%的代谢物,其余的缺失值使用K近邻算法进行填充,数据基于QC样本的随机森林信号漂移进行校正,保留QC样本相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)小于15%的代谢物数据,随后进行总峰面积归一化、对数转换和帕雷托换算。采用Metaboanalyst平台进行单变量分析和SIMCA-P软件进行多变量分析,根据得到的变量投影重要性(Variable importance in projection,VIP)值大于1和Benjamini-Hochberg法校正后的P值小于0.05筛选差异代谢物,最后使用Metaboanalyst平台基于KEGG(Kyoto Encylopaedia of Genes and Genomes)数据库进行通路分析,通路影响值(impact value)>0.1的认为受到显著影响。本研究采用C57Elexacaftor分子量BL/6J小鼠构建酒精戒断模型,研究分为空白对照组、酒精戒断组、美金刚给药组和生理盐水组四组,每组5只。除空白对照组外,其余三组小鼠构建酒精戒断模型,构建方法如下:第一周,每天在固定时间200μL的5%(v/v)酒精溶液进行灌胃,其余时间自由饮用5%(v/v)酒精溶液,第二周、第三周和第四周分别给予10%(v/v)、20%(v/v)和35%(v/v)的酒精溶液,第6、12、18、24天撤除酒精,第7、14、21、28天进行旷场实验和高架十字迷宫实验;美金刚给药组和生理盐水组在第29天开始腹腔注射30 mg/kg的美金刚和200μL生理盐水,每天一次,持续7天,在第36天进行行为学实验。收集小鼠的血清和海马组织,血清用于半定量靶向代谢组学分析,样本的前处理方法以及数据处理和分析与上述相近,使用q RT-PCR检测海马组织中的GLT-1、Glu N1和Glu N2B的m RNA含量。研究结果慢性酒精消耗大鼠的代谢组学数据进行信号漂移校正后大多数QC样品代谢物的RSD分布在30%以内,剔除RSD大于15%的代谢物,得到82个代谢物。根据VIP值和校正后的P值最终筛选得到33个差异代谢物,分别为18个brain histopathology上调代谢物和15个下调代谢物,其中GABA显著上调,谷氨酸、DA、5-羟色胺和天冬氨酸显著下调;通路分析发现8条代谢通路受到显著影响,分别为丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、核黄素代谢、D-Colforsin分子式谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、色氨酸代谢、精氨酸生物合成、生物素代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及酪氨酸代谢。经过四周的酒精戒断诱导后,小鼠进入开放臂的次数比和停留时间比均显著下降(P<0.05),美金刚一周治疗后,小鼠进入开放臂的次数比显著增加(P<0.05),停留时间比有较大程度的增加(P=0.056),说明美金刚能够缓解酒精戒断产生的焦虑症状。血清代谢组学研究结果表明,酒精戒断后缬氨酸和苏氨酸显著上调(Adjusted P<0.05),尿刊酸和谷氨酸显著下调(Adjusted P<0.05),美金刚治疗一周后谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和天冬氨酸均显著上调(Adjusted P<0.05),结合慢性酒精消耗血清代谢组学结果显示谷氨酸均出现显著下调,缬氨酸均出现显著上调;海马组织q RT-PCR结果显示,与空白对照组相比,酒精戒断组Glu N1的m RNA表达增加(P=0.12),生理盐水组显著增加(P<0.05),Glu N2B的m RNA含量在酒精戒断组(P<0.05)和生理盐水组(P<0.01)均显著上调,与生理盐水组相比,在美金刚治疗后Glu N1的m RNA表达显著下调(P<0.05),Glu N2B具有下降的趋势(P=0.16)。研究结论慢性酒精暴露和酒精戒断引起血清中谷氨酸等神经递质的代谢异常与焦虑、抑郁、强迫等精神症状密切相关,说明酒精引起的神经递质的改变可能是诱导酒精成瘾和酒精戒断症状的重要原因。此外,NMDA受体的过度激活可能是酒精戒断后引起焦虑症状的重要原因,美金刚能够通过减少NMDA受体的表达以缓解焦虑症状,说明NMDA受体很可能是酒精戒断综合症重要的治疗靶点,本研究为深入探究美金刚治疗酒精戒断综合症的机制提供基础。