研究目的通过生物信息学和网络药理学虚拟筛选四逆加人参汤(SNRS)治疗急性肝衰竭(ALF)的众多靶点中与糖酵解相关的关键靶基因和关键通路,并对关键靶基因进行免疫浸润分析,为SNRS通过影响糖代谢重编程调控巨噬细胞极化状态发挥治疗效应提供理论基础,并为后续实验设计提供参考思路;进一步通过腹腔注射LPS/D-Gal N构建小鼠ALF模型,开展SNRS治疗ALF的药效学研究,并观察SNRS对肝巨噬细胞亚型浸润情况的影响,验证SNRS治疗ALF的有效性及其对肝巨噬细胞极化状态的调控作用;最后制备并筛选最佳浓度SNRS含药血清,与LPS共处理小鼠RAW264.7巨噬细胞,并基于m TOR/HIF-1α通路探讨SNRS含药血清对LPS诱导活化的巨噬细胞的能量代谢方式及极化状态的影响。为SNRS通过干预免疫代谢重塑巨噬细胞极化状态以治疗ALF提供科学依据。研究方法第一部分四逆加人参汤调控糖酵解治疗ALF潜在靶基因的免疫浸润分析通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)平台下的基因表达综合数据库(GEO)收集乙肝相关性急性肝衰竭(HBV-ALF)、对乙酰氨基酚相关性急性肝衰竭(APAP-ALF)的人体肝组织芯片数据,并对二者各自所表达的差异基因进行筛选;随后,与糖酵解相关基因、SNRS效应靶基因进行取交集处理,从而获得SNRS通过作用于糖酵解干预ALF的潜在靶基因,并对其进行基因功能注释;最后,对比分析ALF和正常肝组织中免疫细胞浸润情况,并将最终获取的靶基因表达水平与ALF肝组织免疫细胞浸润程度进行相关性分析。第二部分四逆加人参汤对LPS/D-Gal N诱导的急性肝衰竭模型的药效学研究采用随机数字表法,将63只ICR小鼠随机分成空白组、模型组、中药组,每组各21只。模型组与中药组均单次腹腔注射D-Gal N(800mg/Kg)+LPS(20μg/Kg),而空白组予以单次腹腔注射等量生理盐水。中药组小鼠分别于造模前48h、24h以及造模后10min予以“四逆加人参汤”灌胃处理,而空白组和模型组于相同时间点予以生理盐水灌胃处理。于注射造模剂后8h,每组随意取6只用于样本取材及标本检测,每组余下的15只小鼠进行生存率分析。实验过程中,观察并记录造模后各组小鼠的精神状态、毛发状况、饮食及二便情况。利用全自动生化分析仪检测小鼠血清ALT、AST;采用ELISA测定TNF-α、HMGB-1、IL-1β、IL-6及IL-10;对肝组织切片进行HE染色,观察肝组织病理学变化;采用免疫荧光染色观察肝组织中M1型、M2型巨噬细胞浸润情况。第三部分四逆加人参汤重塑巨噬细胞极化状态体外实验研究实验一四逆加人参汤含药血清制备及浓度筛选采用随机数字表法将20只SD大鼠分为SNRS组和空白组,每组10只。SNRS组灌服中药,空白组灌服等体积生理盐水。每日给药2次,连续给药3d,末次给药1h后采血。采血后对大鼠全血进行离心、灭活、除菌,制得SNRS含药血清。取对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中,加入LPS100ng/ml以诱导RAW264.7细胞向M1型极化。采用CCK8法检测不同浓度的空白血清、含药血清对正常培养的RAW264.7细胞及LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力的影响,并根据结果设置高、中、低三个血清浓度,用于后续最佳浓度筛选。采用高、中、低浓度含药血清处理LPS诱导活化的RAW264.7细胞24h后,采用ELISA法检测IL-1β、TNF-α浓度,比色法检测LD释放量,Western Blot法检测m TOR、p-m TOR及HIF-1α的表达水平。实验二四逆加人参汤调控m TOR/HIF-1α信号通路影响糖代谢重编程重塑巨噬细胞极化状态取对数生长期的RAW264.7细胞,接种于96孔板中。利用CCK8法检测MHY1485、Rapamycin对未经LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力的影响;检测10%含药血清、10%含药血清+MHY1485、Rapamycin对LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力的影响。取对数生长期的RAW264.7细胞,Gefitinib核磁接种于6孔板中,共设置5个实验分组:(1)空白组;(2)模型组;(3)LPS+含药血清组;(4)LPS+含药血清+m TOR激动剂组;(5)LPS+空白血清+m TOR抑制剂组。药物处理24h后,利用光镜观察细胞形态;流式细胞仪检测分析M1(CD86+CD206)、M2(CD86-CD206+)细胞亚群的比例;WB检测细胞m TOR、p-m TOR及HIF-1α的表达;ELISA检测细胞上清IL-1β、TNF-α及IL-10水平,ELISA检测细胞提取液中HK2、PFK-1、PKM2及LDHA浓度;比色法检测细胞上清LD含量,比色法检测细胞提取液中Ac-Co A、ATP水平。此外,使用透射电镜观察空白组、模型组及LPS+含药血清组细胞超微结构。研究结果第一部分四逆加人参汤调控糖酵解治疗ALF潜在靶基因的免疫浸润分析本研究收集了2个HBV-ALF的表达谱芯片数据集(GSE38941、GSE14668)和1个APAP-ALF的表达谱芯片数据集(GSE120652)。利用韦恩图在线工具将APAPALF差异表达基因集、合并的HBV-ALF差异表达基因集、糖酵解基因集以及SNRS作用靶基因集进行取交集处理;筛选出SNRS调控糖酵解治疗HBV-ALF的作用靶基因共有5个,分别为己糖激酶2(HK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)和谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(GOT1);APAP-ALF并未获得类似基因。HBV-ALF组相较于正常组,HK2、CDK1表达上调,而SOD1、VEGFA和GOT1表达下调。对5个作用靶基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,GO分析结果显示生物过程(BP)主要涉及“对铜离子的响应”、“细胞衰老”、“对镉离子的响应”、“对轴突损伤的反应”、“卵泡发育”等;细胞成分(CC)主要富集在线粒体。KEGG富集通路主要集中在缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、碳代谢等。免疫浸润差异分析提示HBV-ALF肝组织中免疫细胞浸润水平较正常肝组织明显增加。HBV-ALF肝组织中浸润的免疫细胞主要包括树突状细胞、中性粒细胞、M2型巨噬细胞、M1型巨噬细胞、M0型巨噬细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和B细胞等。对5个作用基因与HBV-ALF肝组织中浸润的主要免疫细胞进行相关性分析,结果提示SNRS可以通过作用靶基因影响免疫细胞浸润。第二部分四逆加人参汤对LPS/D-Gal N诱导的急性肝衰竭模型的药效学研究经腹腔注射D-Gal N(800mg/Kg)+LPS(20μg/Kg)诱导构建的ICR小鼠ALF模型,一般情况差,24h死亡率达80%。与空白组相比,ALT、AST水平明显升高;TNF-α、HMGB-1、IL-1β和IL-6的释放明显增加;肝组织病理学损伤严重;肝组织中M1型巨ABT-199化学结构噬细胞标志物CD86表达明显增加,M2型巨噬细胞标志物CD163表达相对增加。经SNRS处理的ALF小鼠,一般情况改善,24h死亡率为26.7%。与模型组相比,ALT、AST水平明显降低;TNF-α、HMGB-1及IL-1β释放明显减少,IL-6水平呈下anti-tumor immunity降趋势,而IL-10表达水平明显增加;肝组织病理学损伤减轻;肝组织中M1型巨噬细胞标志物CD86表达明显减少,M2型巨噬细胞标志物CD163表达明显增加。第三部分四逆加人参汤重塑巨噬细胞极化状态体外实验研究实验一四逆加人参汤含药血清制备及浓度筛选相同稀释浓度下的空白血清与含药血清对正常培养的RAW264.7细胞进行处理,两组细胞活力的组间差异无统计学意义。各稀释浓度(2.5%、5%、10%、15%及20%)的含药血清处理LPS诱导活化的RAW264.7细胞,均可以降低细胞增殖活力。15%、20%浓度的空白血清可以降低LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力。选择2.5%、5%、10%的梯度浓度用于后续最佳含药血清浓度的筛选。SNRS含药血清呈剂量依赖性抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放炎症因子IL-1β、TNF-α,并减少了糖酵解代谢产物LD的生成。LPS诱导状态下的RAW264.7巨噬细胞m TOR/HIF-1α通路相关蛋白表达明显增加,而SNRS含药血清呈剂量依赖性降低p-m TOR/m TOR比值及HIF-1α蛋白相对表达量。实验二四逆加人参汤调控m TOR/HIF-1α信号通路影响糖代谢重编程重塑巨噬细胞极化状态MHY1485、Rapamycin对RAW264.7细胞增殖活力无明显影响。电镜结果显示模型组相较于空白组,细胞线粒体出现了严重肿胀,而SNRS含药血清可以有效改善线粒体肿胀程度。光镜及流式细胞仪结果提示,LPS诱导RAW264.7细胞活化后,M1型、M2型巨噬细胞增多;与模型组相比,含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞后,M1极化细胞减少,M2极化细胞增多;而在含药血清基础上加用MHY1485,可以逆转含药血清对M1型、M2型极化分布的影响。模型组IL-1β、TNF-α表达水平明显增加,IL-10具有增高趋势;含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞,可以抑制IL-1β、TNF-α表达,并显著升高IL-10水平;而MHY1485可以逆转含药血清的抗炎效应。模型组p-m TOR/m TOR比值、HIF-1α相对表达量显著升高;使用含药血清、Rapamycin对LPS诱导活化的RAW264.7细胞进行干预后,p-m TOR/m TOR比值、HIF-1α相对表达量明显降低;而在含药血清基础上加用MHY1485,可以逆转含药血清降低p-m TOR/m TOR比值、HIF-1α相对表达量的作用。模型组HK2、PFK1、LDHA表达水平明显升高,细胞上清中LD含量显著增加;使用含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞,可使HK2、PFK1、LDHA表达水平明显下降,细胞上清中LD含量显著减少;而MHY1485可以逆转含药血清的调控效应。与空白组比较,模型组RAW264.7细胞中Ac-Co A、ATP含量明显减少;与模型组相比,使用含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞,Ac-Co A、ATP含量显著增加;而在含药血清基础上加用MHY1485,AcCo A、ATP含量比单用含药血清明显降低。结论SNRS可以改善ALF小鼠一般状况,提高生存率,降低转氨酶水平,调控炎症介质释放,改善病理学组织损伤,影响肝巨噬细胞亚型浸润分布。肝巨噬细胞作为肝脏固有免疫系统的重要组成部分,参与了ALF发病过程中的免疫损伤。SNRS可以通过调控m TOR/HIF-1α信号通路,抑制HK2、PFK1、LDHA表达,减少LD分泌,增加Ac-Co A生成,促进ATP合成,改善免疫代谢;抑制M1型巨噬细胞激活,促进M2型巨噬细胞活化,重塑巨噬细胞极化状态;降低促炎因子IL-1β、TNF-α表达,增加抗炎因子IL-10分泌,积极发挥抗炎、促修复作用。此外,SNRS还可以保护RAW264.7细胞线粒体结构,维持其线粒体功能。