目的:通过分别移植人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和CD34~+造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)构建免疫人源化小鼠模型,进一步移植人胰腺癌细胞获得肿瘤-免疫系统双人源化小鼠模型,并利用这两种模型探讨吉西他滨联合免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor,ICI)治疗胰腺癌的疗效,以期为临床胰腺癌患者联合免疫治疗提供数据支持。方法:通过Western-Blot检测两种人源胰腺癌细胞系Aspc-1和Bxpc-3的中程序性死亡受体-配体1(Programmed cell death-Ligand 1,PD-L1)的表达水平;采用CCK8测定人源胰腺癌细胞系Bxpc-3的IC50值;使用Western-Blot和流式细胞术检测浓度为15μg/m L的吉西他滨作用于Bxpc-3细胞后PD-L1的表达变化;应用Ficoll密度梯度离心法分离获得健康志愿献血者外周血中新鲜单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),并通过尾静脉注射入5-6周龄雌性重度免疫缺陷小鼠NCG体内,每只小鼠注射剂量为1×10~7/200μL;在PBMC植入1周后,将人胰腺癌细胞系Bxpc-3皮下注射NCG小鼠体内,每只小鼠注射剂量为1×10~7/200μL,从而获得胰腺癌-PBMC免疫系统双人源化小鼠模型(Hu-PBMC)。植入3周后,断尾法采集小鼠的外周血,Ficoll密度梯度离心法分离出小鼠外周血中的PBMC后,使用流式细胞术对小鼠外周血中人CD45~+免疫细胞的比例进行分析,以重建三周后小鼠外周血中人免疫细胞CD45~+含量>20%确定Hu-PBMC人源化小鼠模型构建成功。待小鼠的移植物抗宿主反应(graft-versus-host disease,GVHD)出现明显时,终止实验。Hu-PBMC胰腺癌肿瘤免疫双人源化小鼠模型构建成功后进行分组治疗并定期监测肿瘤的生长情况,评估吉西他滨联合抗程序性死亡-受体1(Programmed cell death 1,PdiABZI STING agonist分子式D-1)单抗治疗胰腺癌的疗效。治疗结束后,收集小鼠的肿瘤,应用免疫组织化学染色和免疫荧光染色分析小鼠肿瘤组织中人免疫细胞的浸润情况。应用Ficoll密度梯度离心法分离出胎儿脐带血中单个核细胞(mononuclear cell,MNC),再用免疫磁珠法(Mini MACS)纯化获得人CD34~+HSC,通过尾静脉方式注入3-4周龄雌性重度联合免疫缺陷小鼠NCG体内,注射剂量为1×10~5/200μL,植入3月后,使用断尾法采集小鼠的外周血,使用Ficoll密度梯度离心法分离出小鼠外周血中PBMC,使用流式细胞术对小鼠外周血中人CD45~+免疫细胞的比例进行分析,以重建3月后小鼠外周血中人免疫细胞CD45~+含量>20%确定CD34~+造血干细胞人源化小鼠模型(CD34~+HSC)构建成功。CD34~+HSC免疫人源化小鼠模型构建成功后,将人胰腺癌细胞系Bxpc-3注射免疫缺陷小鼠皮下,剂量为1×10~7/200μL,从而获得CD34~+造血干细胞-胰腺癌免疫系统双人源化小鼠模型(Hu-HSC)。Hu-HSC双人源化小鼠模型构建成功后,进行分组治疗后并定期监测肿瘤的生长情况,用以评估吉西他滨联合抗PD-1单抗的治疗效果。待实验结束后,取小鼠肿瘤组织,进行免疫组织化学染色和免疫荧光染色,对不同治疗组中小鼠肿瘤组织中人免疫细胞的浸润情况进行分析,分析重建小鼠肿瘤免疫微环境的特点,以此来探讨吉西他滨联合抗PD-1单抗治疗胰腺癌的可能机制。结果:Western-Blot结果显示人源胰腺癌细胞系Bxpc-3中PD-L1高表达,而Aspc-1几乎不表达PD-L1,因此选择Bxpc-3进行后期免疫治疗研究。Western-Blot结果和流式细胞术结果均显示吉西他滨作用人源胰腺癌Bxpc-3细胞72h后,能够上调Bxpc-3细胞中PD-L1的表达。在PBMC-胰腺癌免疫系统双人源化小鼠模型中,当人PBBiophilia hypothesisMC植入3周后,流式细胞术检测显示,小鼠外周血中人免疫分子CD45~+含量>20%。免疫组化染色结果显示小鼠肿瘤组织中h CD45~+、h CD8~+和h CD4~+细胞的浸润,说明成功构建了PBMC-胰腺癌肿瘤免疫双人源化小鼠模型(Hu-PBMC)。CD34~+造血干细胞-胰腺癌免疫系统双人源化小鼠模型中,CAdavosertibD34~+HSC植入12周后,流式细胞术检测结果显示,小鼠外周血中人免疫细胞h CD45~+含量>20%。免疫组化染色结果显示小鼠肿瘤组织中h CD45~+、h CD8~+和h CD4~+细胞的浸润,说明成功构建CD34~+-胰腺癌肿瘤免疫双人源化小鼠模型(Hu-HSC)。体内动物实验显示无论是在Hu-PBMC双人源化模型还是在Hu-HSC双人源化模型中,吉西他滨联合抗PD-1单抗治疗,均能有效抑制胰腺癌的生长,对不同治疗组的小鼠肿瘤进行免疫组织化学染色和免疫荧光染色,结果显示,吉西他滨联合抗PD-1单抗治疗组小鼠肿瘤内CD45~+细胞、CD8~+细胞和PD-L1~+细胞含量显著升高,Ki67~+细胞的含量显著降低。这些结果提示,吉西他滨联合抗PD-1单抗治疗策略可以通过增强胰腺癌组织中CD8~+T细胞的浸润与活化,从而达到治疗胰腺癌的目的。结论:成功构建Hu-PBMC和Hu-HSC胰腺癌双人源化小鼠模型,进一步采用吉西他滨联合抗PD-1单抗治疗,能够增强胰腺癌组织中CD8~+T细胞的浸润与活化,发挥特异性的抗肿瘤效果,从而抑制胰腺癌肿瘤的生长。