背景及目的:器官移植是终末期脏器衰竭患者的有效治疗方式。然而,供体器官供不应求的问题日趋突出。尽管肾移植手术量逐年增加,但远远赶不上等候移植人数的增加,只有约25%的等待移植患者在5年内接受了已故捐献者供体的肾移植。对供体质量要求最高的肺移植手术,仅有20%捐献者的肺脏符合肺移植。在活体供体和脑死亡器官捐献(donation after brain death,DBD)供体无法满足临床需求的情况下,拓展使用边缘供体如心脏死亡器官捐献(donation after cardiac death,DCD)供体,能在一定程度上缓解器官移植供体来源不足的状况,有利于扩大供体池。但是DCD供体器官热缺血时间较长,发生移植物原发性无功能(Primary non-function,PNF)和功能延迟(DelayedBaf-A1溶解度 graft function,DGF)的比例较高。因此,提高边缘供体保存质量,改善移植后的移植物功能,并有效应用于临床是解决供体器官缺乏的重要手段之一。由此可见,边缘供体的拓展应用,有利于扩大供体库,从而使更多的器官衰竭患者得到器官移植的机会,具有重要的临床价值。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)是一种高选择性α_2肾上腺素受体激动剂,具有镇静、镇痛的作用,常用于临床手术麻醉和ICU。Dex通过减少炎症反应,激活抗凋亡信号通路,进而保护细胞免受损伤,其对神经系统、心、肺、肾、肝、小肠等多种器官具有保护作用。惰性气体氙气(Xenon,Xe)和氩气(Argon,Ar)也具有器官保护作用。研究显示,Xe可通过降低Caspase-3表达和抑制肾小管细胞TLR-4/NF-κB的活化,减少促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α,进而实现肾功能保护,提高移植物的存活率,延长移植物的存活时间。Ar在心脏、脑和肾脏缺血再灌注损伤中具有保护作用。在猪肾移植模型中,Ar刺激抗氧化防御和限制炎症,能减轻肾移植物损伤,并提高生存率。这些研究结果,表明Dex、Xe、Ar具有包括移植物在内的多器官保护效应。据此,我们提出假设:在UW器官保存液中加入Dex、Xe、Ar可改善DCD边缘供体的保存质量和移植后的移植物功能。本研究通过基于Dex/惰性气体添加改良威斯康星大学器官保存液(University of Wisconsin solution,UW液)的配制,构建猪DCD边缘供体模型和获取边缘供肾;和通过Dex改良UW液,临床收集热缺血离体人肺组织标本,再用armed conflict改良保存液静态冷藏(static cold storage,SCS)猪DCD供肾和人肺组织,采用HE染色,WB,TUNEL,免疫荧光检测和透射电镜等方法,验证Dex/Xe、Ar能否提高DCD边缘供肾和人肺组织的保存质量,并探索改良保存液对凋亡、程序性坏死、铁寻找更多死亡等不同程序性细胞死亡(programmed cell death)模式的影响。实验方法:(一)右美托咪定/惰性气体改良UW液对猪DCD边缘供肾的保护作用及机制研究1.基于Dex/惰性气体添加的改良UW液的配制改良保存液配方:Solution 1:30%N_2+5%CO_2+65%O_2+UW液;Solution 2:30%N_2+5%CO_2+65%O_2+0.1nM Dex+UW液;Solution 3:30%Xenon+5%CO_2+65%O_2+0.1nM Dex+UW液;Solution 4:30%Argon+5%CO_2+65%O_2+0.1nM Dex+UW液;Solution 5:15%Xenon+15%Argon+5%CO_2+65%O_2+0.1nM Dex+UW液;Solution 6:50%Xenon+5%CO_2+45%O_2+0.1nM Dex+UW液;Solution 7:50%Argon+5%CO_2+45%O_2+0.1nM Dex+UW液;Solution 8:25%Xenon+25%Argon+5%CO_2+45%O_2+0.1nM Dex+UW液按照上述实验设计的改良保存液配方,将30%氮气(N_2)、不同浓度的惰性气体(Xe和/或Ar)往含或不含0.1nM Dex的UW液中以0.5L/min的速度充气20min,完成8种改良保存液的配制。2.建立猪DCD供体模型及边缘供肾的获取小香猪镇静后监测生命体征,肝素化,通过静脉注射过量麻醉药物丙泊酚和顺阿曲库铵诱导猪心跳、呼吸停止,完成猪DCD供体模型构建。然后行开胸开腹术,用含肝素的生理盐水进行循环灌洗,待热缺血30min时摘取肾脏,完成边缘供肾的获取。3.验证改良保存液对DCD供体肾脏的保护作用及其对凋亡、程序性坏死、铁死亡的影响DCD边缘供肾获取后经上述8种改良保存液SCS 24h或72h后行HE染色,并用双盲法对切片进行组织损伤评分,观察和评估Dex联合惰性气体对DCD边缘供肾SCS后的病理改变。通过TUNEL检测肾组织细胞凋亡,免疫荧光检测磷酸化混合系列蛋白激酶样结构域蛋白(phosphorylation mixed lineage kinase domain like protein,pMLKL)和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的表达,验证改良保存液对凋亡、程序性坏死和铁死亡信号通路的影响。(二)右美托咪定改良UW液对热缺血离体人肺组织的保护作用及机制研究在临床肺叶切除病例中,从切下的肺叶组织按采集标准获取正常人体肺组织(热缺血离体人肺组织),用Dex改良UW液SCS肺组织16h模拟供体肺冷保存状态,采用HE染色,TUNEL,WB,免疫荧光和电镜检测方法,评估Dex对人肺组织冷保存的作用,并检测添加Dex改良UW液对细胞凋亡、程序性坏死和铁死亡的影响。实验结果:(1)通过静脉注射过量麻醉药物丙泊酚和顺阿曲库铵后,5头小香猪均心搏停止,成功构建猪DCD供体模型,建模成功率100%。(2)Dex联合惰性气体可改善猪DCD边缘供肾SCS 24h和72h后的形态与结构,减轻肾组织损伤。与NC组(非冷藏组)相比,CI24h和CI72h组显著降低了平均肾小管、肾小球健康细胞比率和增加肾损伤评分(P<0.001～0.0001)。与CI24h组相比,除CI24h+Dex组外,所有Dex联合Xe和/或Ar组均提高了肾小管健康细胞的比率(P<0.05);添加Dex+50%Xe/50%Ar/25%Xe+25%Ar组能提高肾小球健康细胞比率(P<0.01);添加Dex+50%Xe/50%Ar/15%Xe+15%Ar/25%Xe+25%Ar/组能降低SCS 24h的肾损伤评分(P<0.05)。与Dex+15%Xe+15%Ar组相比,Dex+25%Xe+25%Ar组肾损伤评分降低(P<0.05)。在SCS 72h的移植肾中,肾组织严重损伤。与CI72h组相比,添加Dex+50%Xe/50%Ar/25%Xe+25%Ar组能提高肾小管健康细胞比率(P<0.05);添加Dex+30%Ar/15%Xe+15%Ar/50%Xe/50%Ar/25%Xe+25%Ar组能提高肾小球健康细胞的比率(P<0.05);Dex+50%Xe/50%Ar/25%Xe+25%Ar能降低SCS 72h的肾损伤评分(P<0.05)。与Dex+30%Ar组相比,Dex+50%Ar组可提高肾小管健康细胞的比率且降低肾损伤评分(P<0.05),Dex+50%Ar组显示出对肾更好的保护效果。(3)Dex和/或惰性气体可减少猪DCD边缘供肾SCS 24h和72h的细胞凋亡。与NC组相比,CI24和CI72组TUNEL阳性细胞数量增加(P<0.05)。与CI24h和CI72h组相比,添加Dex/Dex+Xe/Dex+Ar/Dex+Xe+Ar的所有组TUNEL阳性细胞数量均减少(P<0.05)。CI24h+Dex+50%Ar组比CI24h+Dex+30%Ar组、CI24h+Dex+50%Xe组的TUNEL阳性细胞数量更少(P<0.05)。(4)Dex和/或惰性气体可降低猪DCD边缘供肾SCS 24h和72h的pMLKL的表达量,但只有24h组具有统计学意义。与NC组相比,CI24和CI72h组pMLKL表达量增加(P<0.05)。与CI24h组相比,添加Dex/Dex+Xe/Dex+Ar/Dex+Xe+Ar的所有组pMLKL表达量均下降(P<0.05)。(5)Dex和/或惰性气体对猪DCD边缘供肾SCS 24h和72h的GPX4的表达量无明显影响。与NC组相比,CI24h和CI72组GPX4表达量增加(P<0.05)。与CI24h和CI72h组相比,添加Dex/Dex+Xe/Dex+Ar/Dex+Xe+Ar的所有组GPX4表达量无明显变化(P>0.05)。(6)Dex可改善热缺血离体人肺SCS 16h的形态与结构,能减轻肺上皮细胞和内皮细胞损伤,降低肺损伤评分(P<0.01);Dex也可降低TUNEL+凋亡细胞数量和pMLKL表达(P<0.05)。(7)Dex对热缺血离体人肺SCS 16h的GPX4的表达量无明显改变(P>0.05)。结论:1.采用静脉注射过量丙泊酚和顺阿曲库铵的方法可有效建立猪DCD边缘供体模型。2.Dex联合Xe、Ar添加改良的UW液对长时间SCS猪DCD边缘供肾能提供更好的保护作用,其机制涉及降低细胞凋亡和程序性坏死。3.改良保存液的配方中,Dex+50%Ar添加改良的UW液展现出最佳的保护效果。4.所构建的猪DCD边缘供肾发生了铁死亡,添加Dex/Dex+Xe/Dex+Ar/Dex+Xe+Ar的UW液不能改善该细胞死亡模式。5.Dex能降低热缺血离体人肺组织SCS的损伤,其机制与抑制细胞凋亡和程序性坏死有关,未涉及对细胞铁死亡的调控。