[背景]卵巢癌是妇科致死率最高的恶性肿瘤,严重影响女性身心健康,给社会带来沉重经济负担,是妇产科的研究热点,也是尚未攻克的难点。卵巢癌的传统治疗方法包括根治性手术切除、化疗以及靶向治疗,尽管这些方法延长了生存期,但复发率仍然较高,全球范围内数据显示5年生存率不足50%。近年来,免疫治疗技术的发展为改善卵巢癌治疗效果提供了新方向。嵌合抗原受体 T 细胞(Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T cell)疗法是一种新型、有前景、可能治愈恶性肿瘤的免疫治疗方法。简单地说,CAR-T细胞由CAR和T淋巴细胞两部分构成,CAR的作用是特异性识别和结合肿瘤细胞,而T淋巴细胞的作用是杀伤肿瘤细胞,二者组合后完成靶向杀伤肿瘤细胞。CAR-T细胞疗法在复发或难治性大B细胞淋巴瘤成人患者中已进入临床应用阶段,2021年6月23日我国国家监督管理局批准了首个CAR-T细胞制剂(阿基仑赛注射液)上市。但是,CAR-T细胞疗法在卵巢癌中的应用仍处于临床前研究阶段,因为卵巢癌属于实体瘤,它与血液肿瘤有许多不同之处,目前仍面临诸多困境,例如,肿瘤抗原逃逸、难以归巢和定殖、脱靶效应和免疫抑制肿瘤微环境,这些问题将直接影响CAR-T细胞的治疗效果。另外,不同病理类型卵巢癌表达的肿瘤抗原类型存在差异,因此,选择恰当的肿瘤抗原对于CAR-T细胞的疗效至关重要。尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR)、人表皮生长因子受体 2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)都是肿瘤抗原。研究发现,uPAR或HER2的上调与卵巢癌的发生、进展和转移有关。然而,同时靶向uPAR和HER2的双靶向CAR-T细胞杀伤卵巢肿瘤的研究尚无报告。为了解决CAR-T细胞在卵巢癌治疗中的肿瘤抗原逃逸和难以归巢和定殖问题,我们构建了一种新型、双靶向、串联、第三代uPAR/HER2-CAR-T细胞,以期提高CAR-T细胞靶向杀伤上皮性卵巢癌的效果,并阐明作用机制,为临床转化和应用提供理论依据。[目的]1.为了解决CAR-T细胞在卵巢癌治疗中的肿瘤抗原逃逸、难以归巢和定殖问题,构建一种新型双靶向串联CAR-T细胞,以提高CAR-T细胞靶向上皮性卵巢肿瘤细胞的杀伤效果;2.探索双靶向串联CAR-T细胞杀伤上皮性卵巢肿瘤的相关作用机制,为临床转化和应用提供理论依据。[方法]1.通过qRT-PCR、流式细胞术和免疫组化方法观察4种人上皮性卵巢癌细胞(ES-2、SKOV3、OVTOKO、A2780)和 1 种人正常卵巢上皮细胞(Hosepic)的uPAR和HER2抗原表达情况;选择uPAR+/HER2+卵巢癌细胞,通过RNA干扰技术分别构建uPAR低表达和HER2低表达的卵巢癌细胞;2.利用第三代CAR的基本框架设计双靶向uPAR和HER2抗原的串联CAR结构,然后通过慢病毒进行包装;通过密度梯度离心法提取人外周血T淋巴细胞,采用慢病毒转导法构建uPAR/HER2-CAR-T细胞;通过流式细胞术检测T淋巴细胞中CD3、CD4、CD8的表达情况;3.将5种效应细胞(即T细胞、Control-CAR-T细胞、uPAR-CAR-T细胞、HER2-CAR-T 细胞、uPAR/HER2-CAR-T 细胞)与 4 种靶细胞(即 uPAR+/HER2+、uPAR+/HER2-、uPAR-/HER2+和uPAR-/HER2-的卵巢癌细胞)进行共培养,通过乳酸脱氢酶释放实验观察效应细胞对靶细胞的杀伤效果,确定最佳效靶比;在最佳效靶比条件下,通过细胞因子同步检测试剂盒检测效靶杀伤实验下Th细胞因子的分泌能力;采用ELISA法检测效靶杀伤实验中颗粒酶B的Akt抑制剂释放水平;4.将ES-2细胞种植于BALB/c-nu免疫缺陷鼠皮下,构建荷瘤小鼠模型;成瘤后,经尾静脉注射效应细胞,根据效应细胞类型分5个实验组:即T细胞组、Control-CAR-T 细胞组、uPAR-CAR-T 细胞组、HER2-CAR-T 细胞组和uPAR/HER2-CAR-T细胞组;取出肿瘤组织后,记录各组小鼠肿瘤的平均体积和平均质量,qRT-PCR评估肿瘤组织内的CAR拷贝量,HE染色和免疫荧光观察肿瘤组织内CD3+细胞数量;通过Luminex技术检测5组小鼠血液中的细胞因子种类和含量。[结果]1.qRT-PCR检测结果显示ES-2细胞的uPAR和HER2的基因相对定量分别是Hosepic细胞的8.69倍和7.70倍;流式细胞术检测结果显示ES-2细胞表面uPAR和HER2的表达率分别为94.80%和98.48%;免疫组化结果显示ES-2细胞表面uPAR和HER2同时呈阳性表达;qRT-PCR检测结果和流式细胞术结果显示成功构epigenomics and epigenetics建了 uPAR低表达的sh-uPAR-ES2细胞和HER2低表达的sh-HER2-ES2 细胞;2.构建了双靶向uPAR和HER2的串联CAR-T细胞,跨膜区为CD8α,胞内信号区为CD28-CD137-CD247;T淋巴细胞体的流式细胞术鉴定结果显示CD3阳性比例为98.20%;与正常细胞相比,各CAR-T细胞CD8细胞比例多于CD4细胞;流式细胞术检测结果显示双靶串联CAR慢病毒对于T淋巴细胞的转导效率为73.70%;3.uPAR/HER2-CAR-T 细胞对 ES-2(uPAR+/HER2+)、A2780(uPAR-/HER2-)、sh-uPAR-ES2(uPAR-/HER2+)和 sh-HER2-ES2(uPAR+/HER2-)细胞有不同程度的杀伤作用,对ES-2细胞的杀伤作用最强,其裂解率为86.29±0.23%;uPAR/HER2-CAR-T细胞对ES-2细胞的最佳效靶比为10:1;对于相同类型的靶细胞,uPAR/HER2-CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果优于uPAR-CAR-T细胞和HER2-CAR-T细胞,并且分泌了更多的IFN-γ、TNF-α、IL-2和颗粒酶B;4.与 T 细胞组、Control-CAR-T 细胞组、uPAR-CAR-T 细胞组和 HER2-CAR-T细胞组相比,uPAR/HER2-CAR-T细胞组种植瘤的平均体积更小、平均质量更小、肿瘤组织内CAR拷贝量更多、CD3+细胞数量更多、以及血液中selleck合成肿瘤杀伤作用的细胞因子水平更高(如IFN-γ、TNF、IL-2)。[结论]1.uPAR/HER2-CAR-T细胞在上皮性卵巢癌的治疗中能够克服肿瘤抗原逃逸、难以归巢及定殖的问题,提高了卵巢癌的治疗效果;2.uPAR/HER2-CAR-T发挥高效抗肿瘤作用的机制是其提高了与靶抗原识别和结合能力,并且分泌大量颗粒酶B、IFN-γ、TNF和IL-2等细胞因子。