卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是当前南方深水网箱养殖最主要的养殖品种,具有重要的经济价值,但近年来各类疾病频发,严重制约了其养殖产业健康发展。已有研究发现,胰岛素样生长因子结合蛋白(Insulin-like growth factor binding protein,IGFBPs)在调控细胞凋亡、促进生长发育、调节免疫细胞的功能和炎症反应等调控发挥着重要的作用。然而,目前有关IGFBPs的研究主要集中于哺乳动物等高等脊椎动物,硬骨鱼的相关研究相对匮乏。本文基于卵形鲳鲹的转录组,克隆鉴定了卵形鲳鲹IGFBPs家族的4个同源基因TroIGFBP2a、TroIGFBP2b、TroIGFBP5a和TroIGFBP5b,分析了它们在卵形鲳鲹抗细菌侵染中的功能,并从多个方面深入探讨了TroIGFBP5b参与机体的抗细菌免疫机制。主要结果如下:(1)TroIGFBP2a/2b和TroIGFBP5a/5b基因的克隆鉴定和表达分析TroIGFBP2a/2b的开放阅读框(Open reading frames,ORF)分别为861 bp和810 bp,编码286个和269个氨基酸;TroIGFBP5a/5b的ORF长度分别为810 bp和801 bpCX-5461,编码269个和266个氨基酸。序列分析结果表明,TroIGFBP2a/2b和TroIGFBP5a/5b均由信号肽、胰岛素样生长因子结合结构域、甲状腺球蛋白I型重复结构域三部分组成。TroIGFBP2a/2b和TroIGFBP5a/5b在脊椎动物的进化中高度保守。系统进化树分析可以表明,其中TroIGFBP2a和2b分别与硬骨鱼的IGFBP2a和IGFBP2b聚为一支,TroIGFBP5a和TroIGFBP5b分别与硬骨鱼的IGFBP5a和IGFBP5b聚为一支;氨基酸序列的同源比对结果显示,在四个基因中,TroIGFBP5b的保守程度最高,与非硬骨鱼类脊椎动物(哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鸟类)的同源性为51.66%～58.74%;与硬骨鱼IGFBP5b的同源性为70.22%～97.38%。此外,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)结果表明,TroIGFBP2a/2b和TroIGFBP5a/5b在健康卵形鲳鲹多种组织中均能表达,但是表达分布有所差异。TroIGFBP2a/2b和TroIGFBP5b在肝脏中表达量最高,而TroIGFBP5a在肠道中的表达量最高;哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)刺激后,TroIGFBP2a/2b和TroIGFBP5a/5b在肝、脾、头肾和肠道中的转录水平的表达量均显著增加,且呈现先增高再降低的趋势,其中TroIGFBP5b的表达量最高,结果推测TroIGFBP2a/2b和TroIGFBP5a/5b可能参与了机体抗细菌免疫应答,而TroIGFBP5b应答Nucleic Acid Detection反应最强。(2)TroIGFBP5b的体内和体外抗细菌免疫作用研究基于上述结果,本论文进一步对TroIGFBP5b的抗细菌免疫作用进行了研究。首先构建了TroIGFBP5b的原核表达载体,获得TroIGFBP5b的活性重组蛋白r TroIGFBP5b。体外实验结果表明,r TroIGFBP5b可显著促进头肾淋巴细胞(head kindey lymphocytes,HKLs)的增殖,并显著提高头肾巨噬细胞(head kindey macrophages,HKMs)的吞噬作用。亚细胞定位的结果显示,TroIGFBP5b在卵形鲳鲹吻细胞(Golden pompano snout cell,GPS)的细胞核与细胞质中均可定位,但只有成熟的TroIGFBP5b(不含信号肽)才能进入细胞核。体内过量和干扰表达的实验结果表明,TroIGFBP5b在体内过量表达,可以显著提高机体抗哈维氏弧菌的能力;而TroIGFBP5b干扰表达,该能力则显著下降。上述结果表明TroIGFBP5b可显著激活卵形鲳鲹的免疫细胞,参与机体抗细菌免疫过程。(3)TroIGFBP5b基因中发挥抗细菌免疫作用的关键基序研究为了探索TroIGFBP5b发挥抗细菌免疫功能的关键基序,本文克隆了分别缺失了~(65)GVY~(67)、~(235)CWCV~(238)和肝素结合基序(Heparin-binding motif,HBM,序列为~(220)KRKQCK~(225))的TroIGFBP5b三个突变体:TroIGFBP5b-ΔGVY、TroIGFBP5b-ΔCWCV和TroIGFBP5b-ΔHBM。进一步实验表明,过量表达TroIGFBP5b-ΔHBM组与过量表达TroIGFBP5b组相比,机体的抗细菌作用及一些免疫相关细胞因子,包括IL-8、IL-10、IL-1β、TNF-α的表达水平均显著降低;而TroIGFBP5b-ΔGVY组和TroIGFBP5b-ΔCWCV组无显著变化;以上表明,HBM在TroIGFBP5b发挥抗细菌免疫功能中具有重要作用。同时,体外功能验证实验也发现,缺失HBM的重组蛋白r TroIGFBP5b-ΔHBM丧失促进HKLs增殖和HKMs的吞噬作用的功能。亚细胞定位研究结果显示,TroIGFBP5b及上述三个缺失突变体均定位于GPS细胞的细胞质;在哈维氏弧菌(V.harveyi)和LPSBemcentinib的刺激下,部分TroIGFBP5b从细胞质转移到细胞核,而TroIGFBP5b-ΔHBM组则无核转移现象。据此,我们推测TroIGFBP5b的抗细菌作用可能需要其进入细胞核才能发挥,而缺失HBM基序阻碍了其由细胞质进入细胞核,因而使其丧失了激活细胞的功能。以上实验提示HBM基序是TroIGFBP5b抗细菌免疫过程的关键基序。(4)TroIGFBP5b及其HBM基序参与NF-κB信号通路的研究为了了解TroIGFBP5b是否通过NF-κB通路发挥功能以及其HBM在该过程中的作用,本论文采用双荧光素酶报告基因体系,实验发现,TroIGFBP5b可激活NF-κB活性,并呈现一定的浓度依赖性;而缺失HBM的突变体TroIGFBP5b-ΔHBM不能激活NF-κB通路。进一步的免疫荧光实验结果发现,过量表达TroIGFBP5b可促进p65蛋白向细胞核内转移,而过量表达TroIGFBP5b-ΔHBM则无法促进p65的核转移。此外,体内过量表达TroIGFBP5b可以上调肝、脾和头肾中NF-κB通路相关基因(p65和IKBα)的表达水平;而体内过量表达TroIGFBP5b-ΔHBM对这些基因的表达基本无影响。说明TroIGFBP5b参与了卵形鲳鲹NF-κB免疫信号通路,且HBM基序在此过程中发挥了重要作用。(5)TroIGFBP5b衍生肽抗菌及免疫调节作用的研究为了探究TroIGFBP5b本身是否具有抗细菌作用,根据TroIGFBP5b的序列特征,本论文以化学方法合成了一段长度为22个氨基酸且包含HBM的衍生肽TroIGFBP5b-22(序列为:SLYLPNCDRKGFFKRKQCKPSR)。软件分析显示TroIGFBP5b-22是一个两亲性的阳离子多肽,分子量较小。体外抑菌实验表明,TroIGFBP5b-22对金黄色葡萄球菌和溶藻弧菌均具有明显的抗菌活性,其对溶藻弧菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)分别是32μM和64μM,且其抑菌作用呈现浓度依赖性。进一步实验还发现,TroIGFBP5b-22可以显著抑制小鼠肝癌细胞Hepa 1-6的增殖并促进其凋亡,且具有促进卵形鲳鲹吻细胞GPS生长的作用。说明TroIGFBP5b的衍生肽TroIGFBP5b-22除具有一定的抗菌活性外,还具有免疫调节作用,为解析TroIGFBP5b参与卵形鲳鲹抗细菌免疫的机制提供了依据。通过以上研究,我们证实了卵形鲳鲹TroIGFBP2a/2b和TroIGFBP5a/5b参与机体抗细菌免疫,探讨了TroIGFBP5b参与机体的抗细菌免疫的机制。这些研究结果不仅丰富了我们对鱼类IGFBPs抗细菌免疫的认知,也对深入探索鱼类天然免疫机制具有重要意义。