背景抑郁症是一种多因素起源的严重精神障碍,表现为持续悲伤、失去兴趣,伴infectious period社交退缩,严重者导致自杀,可与多种疾病共病。临床研究报道,视觉障碍患者与抑郁症存在较高(14-44%)的共病率,但目前其共病相关机制的基础研究较少,究其原因为缺乏有关的实验动物模型。因此,建立一种稳定可行的视网膜损伤动物模型,解析其与应激性抑郁症的相关性及发生机制可为后续研发精准防治策略提供十分重要的实验室依据。光遗传学技术的迅猛发展为我们构建视网膜损伤动物模型提供了新思路。研究表明新型光遗传学病毒AAV-Lovsoc-STIM1可对420-560 nm波长的光照响应,促使胞内的基质相互作用分子1(Stromal interaction molecular 1,STIM 1)激活细胞膜上的钙离子释放激活的钙离子通道(Calcium release activated calcium channel,CRAC),驱动Ca~(2+)从细胞外进入细胞内,细胞发生钙超载病理改变。因此,本研究利用此原理,向小鼠玻璃体内注射该光敏修饰STIM1病毒感染视网膜细胞,蓝光照射下可实时有效地调控视网膜细胞膜上CRAC通道的状态,持续照射可致CRAC通道持续开放发生钙超载死亡。可见,该方式能有效快速地调控小鼠视网膜组织发生进行性受损而构建动物模型。视网膜作为中枢神经系统的延伸,不仅参与视觉形成,也可影响其他脑功能活动,包括情绪和认知,因此视网膜损伤可能导致应激性抑郁症发生。越来越多的证据表明,神经炎症点击此处在抑郁症的病理过程中发挥着关键作用。大脑内各种胶质细胞在生理条件下保持着正确的通信,但当机体面对不同程度的应激事件时,中枢神经系统的先天性免疫细胞小胶质细胞迅速激活,诱导促炎性介质的合成和分泌增加,抑制少突胶质细胞成熟,导致髓鞘形成障碍,阻断了跨神经系统不同区域的正常通信,破坏神经系统正常功能,对情绪和认知功能产生负面效应。但视网膜损伤后应激性抑郁的发生是否与神经炎症、脱髓鞘病变相关还有待探究。此外,海马体作为边缘系统中的主要结构,是众所周知调控情感的靶脑区,脑内出现神经炎症时海马体极易受到影响并发生功能障碍。综上,我们推测视网膜损伤与应激性抑郁症共病时视觉通路相关脑区发生神经炎症,白质区出现脱髓鞘样病变及海马体发生功能障碍。方法本研究分两部分进行。第一部分,建立光敏视网膜损伤致应激性抑郁症动物模型。首先确定诱导视网膜损伤的最佳光照模式。构建并向小鼠玻璃体内注射AAV-Lovsoc-STIM1病毒,病毒感染14d后每天用蓝光(波长460-465 nm、照明度5000 lx)分别照射0、1、2和3 h,连续处理7 d后对视网膜各层细胞病理损伤状况进行对比,筛选获得致视网膜损伤的最佳光照条件。其次,将动物随机分为三组:光敏-组(注射Lovsoc-STIM1病毒后无蓝光光照组),空载+组(注射空载病毒后蓝光照射组),光敏+组(注射Lovsoc-STIM1病毒后蓝光照射组)。对比观察三组小鼠视网膜病理变化情况;并联合使用旷场实验、蔗糖偏好实验、强迫游泳实验和悬尾实验四项抑郁相关行为学检测方法评定模型小鼠是否出现抑郁样行为,计算出现抑郁样行为的阳性率。第二部分,探究光敏视网膜损伤与应激性抑郁共病小鼠的视觉通路相关脑区炎性环境变化、神经细胞凋亡发生及白质区髓鞘结构改变、海马体神经炎症发生情况。采用免疫荧光染色法对比观察光敏-组、空载+组和光敏+组小鼠视皮层V2MM区、背外侧膝状核(Dorsal lateral geniculate nucleus,DLG)中小胶质细胞的形态和数量改变;RT-PCR法分别检测三组小鼠视皮层中促炎性细胞因子IL6 m RNA、趋化因子巨噬细胞炎性蛋白1α(Macrophage inflammatory protein 1α,MIP-1α)m RNA的表达情况;采用蛋白免疫印迹法(Western-blot,WB)对比检测三组小鼠视皮层中S100B蛋白、凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3蛋白、白质区髓鞘碱性蛋白(Myelin Basic Protein,MBP)蛋白的表达情况;用免疫荧光染色法观察三组小鼠脑白质中胼胝体(Corpus callosum,selleckchemcc)区、扣带回(Cingulate gyrus,cg)区MBP荧光信号分布及表达情况、海马体中小胶质细胞与星形胶质细胞的变化情况。结果第一部分结果如下:1.AAV-Lovsoc-STIM1-m Cherry病毒注射14 d后,在视网膜各层细胞中均观察到红色荧光信号,尤其在神经节细胞层和外核层细胞中表达较强,提示视网膜具备光敏特性。2.AAV-Lovsoc-STIM1-m Cherry病毒表达后,与光照0、1、2 h/d相比,3 h/d连续7d的蓝光照射组小鼠视网膜外核层细胞、内核层细胞、神经节细胞层的细胞密度均显著减少(P<0.05)。提示每天蓝光照射3 h,连续7 d为诱导视网膜损伤的最佳蓝光照射模式。3.在最佳光照模式下,三组小鼠视网膜HE染色结果显示,光敏+组小鼠的视网膜与光敏-组和空载+组小鼠相比,呈现固缩细胞增多、各层细胞排列紊乱、细胞间裂隙增大等镜下表现,且视网膜各层细胞密度减少(P<0.05),提示在最佳蓝光照射条件下,光敏+组小鼠视网膜发生病理损伤。4.与光敏-组和空载+组小鼠相比,光敏+组小鼠在旷场实验中进入中心区域的次数、在中心区域活动的路程以及旷场中活动总路程均减少,阳性率为65.12%;蔗糖偏好实验中糖水偏好指数明显降低,阳性率为60.47%;强迫游泳实验、悬尾实验中不动时间均增加,阳性率分别为72.09%、76.74%;韦恩图计算显示在四项行为学实验评定中,四项指标均为阳性的比例为23.26%。提示视网膜损伤小鼠出现了应激性抑郁样表现。第二部分结果如下:1.免疫荧光染色镜下结果显示光敏+组抑郁共病小鼠视觉相关脑区V2MM区、DLG中Iba-1~+小胶质细胞胞体增大、树突分枝增多,呈现活化状态,其细胞密度均显著高于光敏-组和空载+组,有统计学意义(P<0.05),提示视觉通路中小胶质细胞活化。2.RT-PCR检测结果发现,与光敏-组和空载+组相比,光敏+组抑郁共病小鼠视皮层中促炎性介质IL-6和MIP-1αm RNA的表达明显上调(P<0.0001),提示促炎性介质合成增加;WB结果表明,光敏+组抑郁共病小鼠视皮层中S100B蛋白和Cleaved caspase-3蛋白的表达水平明显高于光敏-组和空载+组小鼠(P<0.001),提示神经细胞凋亡发生。3.WB检测结果显示,光敏+组抑郁共病小鼠脑白质区MBP蛋白表达水平显著低于光敏-组和空载+组小鼠(P<0.05);免疫荧光染色镜下结果显示光敏+组抑郁共病小鼠脑白质中cc区、cg区的MBP荧光信号分布不均,出现不同程度缺失,且相对荧光强度明显弱于光敏-组和空载+组小鼠(P<0.0001),与WB结果一致,提示白质区出现脱髓鞘病变。4.免疫荧光染色结果显示,小胶质细胞与星形胶质细胞在光敏+组抑郁共病小鼠的海马体处形态发生改变、密度增多(P<0.0001),提示海马体发生神经炎症反应。结论1.AAV-Lovsoc-STIM1病毒注射14 d后,蓝光照射3 h/d、连续7 d时视网膜各层细胞发生病理性损伤,成功构建了光驱动视网膜损伤动物模型。2.23.26%的视网膜损伤模型小鼠,表现出焦虑、快感缺失、绝望等抑郁样症状,发生应激性抑郁症。3.光敏视网膜损伤致应激性抑郁小鼠的视觉形成脑区(V2MM、DLG)中小胶质细胞被激活;视皮层促炎性介质(IL-6、MIP-1α)合成增多,神经细胞发生凋亡;脑白质cc区和cg区发生脱髓鞘病变;海马体中小胶质细胞与星形胶质细胞募集、活化。总之,光敏修饰STIM1成功建立了视网膜损伤与应激性抑郁的共病模型。该应激性抑郁的发生与脑内视觉通路及海马体内的神经炎症反应、视皮层神经细胞的凋亡以及白质的脱髓鞘性损伤相关。