第一部分体外氟康唑诱导实验获得光滑假丝酵母菌耐药株及耐药基因PDR1及ERG11的突变分析目的探索体外氟康唑长期暴露后对临床血培养分离的光滑假丝酵母菌的抗真菌药敏特性的影响,同时分析经诱导实验后氟康唑耐药相关基因PDR1及ERG11的的突变情况。方法收集安徽医科大学第一附属医院检验科血培养分离的5株光滑假丝酵母菌,用MALDI-TOF MS质谱分析对菌株进行鉴定,ATB Fungus 3抗真菌药敏实验确定为氟康唑敏感株,通过体外氟康唑长期暴露实验发展为氟康唑耐药株,并于无氟康唑培养基中继续传代培养确定其耐药的稳定性。通过DNA测序技术分析光滑假丝酵母菌氟康唑耐药相关基因PDR1,ERG11的基因序列,用DNAMAN软件对比氟康唑敏感株和耐药株基因序列改变,并与Gen Bank中序列进行比对发现碱基和蛋白质突变位点。结果经过体外氟康唑诱导后,5株光滑假丝酵母菌血流感染株不仅发生了氟康唑耐药,还导致了与三唑类抗真菌药物伊曲康唑、伏立康唑三者之间的交叉耐药。耐药基因测序及序列比对发现PDR1基因发生3种碱基突变位点:G1127A、G2315A、G4681A,对应的蛋白质突变位点为R376Q、R772K、E1083K,ERG11基因发现1种碱基突变位点C405A,对应的蛋白质突变位点为F135L,均为新发现的突变位点,此前未见报道过。结论光滑假丝酵母菌体外长时间氟康唑暴露后可导致耐药和三唑类之间的交叉耐药,并且这种耐药特性保持稳定。光滑假丝酵母菌三唑类耐药后可发生耐药相关PDR1,ERG11基因的突变。第二部分光滑假丝酵母菌氟康唑耐药相关基因的m RNA表达水平及外排泵功能分析目的分析经体外氟康唑诱导实验后光滑假丝酵母菌耐药相关基因PDR1,ERG11及外排泵转运蛋白编码基因CDR1,CDR2和SNQ2的m RNA相对表达量的改变,同时分析光滑假丝酵母菌外排泵功能的改变,探究其与三唑类耐药之间的关系。方法将第一部分筛选出的5株氟康唑敏感株和其经过诱导后获得的5株耐药株使用实时荧光定量PCR分析光滑假丝酵母菌耐药相关基因PDRAortic pathology1,ERG11及外排泵编码基因CDR1,CDR2,SNQ2的m RNA相对表达量改变,同时使用R-6G荧光染料分析光滑假丝酵母菌外排泵功能的改变。结果光滑假丝酵母菌氟康唑诱RAD001生产商导耐药组的耐药相关基因PDR1,ERG11,CDR1,CDR2,SNQ2的m RNA相对表达水平均发生明显上调(p<0.05),其中PDR1,ERG11基因的m RNA相对表达量分别为(7.525±1.239),(4.004±1.720)。而外排泵蛋白编码基因CDR1(6.902±2.087LY2835219化学结构)的m RNA表达量比CDR2(2.925±0.866)、SNQ2(2.325±0.815)增加更明显。流式细胞计数分析结果显示与光滑假丝酵母菌氟康唑敏感组相比较,耐药组对R-6G的吸收明显减少,外排作用增强(p<0.05)。结论体外长期氟康唑暴露可导致光滑假丝酵母菌耐药相关基因PDR1,ERG11及外排泵编码基因CDR1,CDR2,SNQ2的m RNA相对表达量明显增加,同时光滑假丝酵母菌的主动外排作用增加,从而促进耐药的发生。