β-1,4-内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)能随机切割β-1,4糖苷键,在洗涤、纺织、造纸、能源等行业有重要应用价值。在洗涤行bio-based polymer业,β-1,4-内切葡聚糖酶具有改善棉纤维的柔软性,提高洗涤效率等作用。目前,本土化的洗涤酶制剂尚未得到有效的开发,获得一种新型洗涤酶制剂对于国内洗涤酶制剂的发https://www.selleck.cn/products/BafilomycinA1.html展具有重要意义。论文通过基因挖掘和生物信息学筛选获得具有低温特性的β-1,4内切葡聚糖酶,并在大肠杆菌中实现了异源表达;在此基础上,通过序列比对和蛋白质p K_a值计算等理性设计策略进行分子改造,成功提高了β-1,4-内切葡聚糖酶的耐碱性和催化效率,最后初步解析了内切葡聚糖酶耐碱性提高的分子机制。论文主要研究结论如下:(1)通过基因挖掘和生物信息学方法从数据库中筛选出三株β-1,4-内切葡聚糖酶基因,通过载体p ET-22b(+)在E.coli BL21(DE3)中实现了高效表达;分析了其催化活性和酶学性质,其中Eg DC酶在20℃保持75%以上的相对酶活,具有潜在的洗涤行业应用价值。(2)通过氨基酸序列比对和计算氨基酸残基p K_a值两种策略确定了28个耐碱性的相关潜在位点。定点突变构建了36个单突变体,表征并比较了野生酶与突变体的比酶活和酶学性质,筛选获得V73K、N122R、P131K、A168K和A208K五个耐碱性提高的单突变体。其中单突变体V73K的耐碱性提高且催化性能(k_(cat)/K_m值)提高了57.1%,单突变体P131K的比酶活上升最明显,相比野生酶提高了21.8%。(3)获得具有良好洗涤应用价值的β-1,4-内切葡聚糖酶双突变体V73K/A168K。通过组合突变构建了5个组合突变体V73K/N122R、V73K/P131K、V73K/A168K、V73K/A208K和V73K/N122R/A168K,其中V73K/A168K突变体的最适p H值提高至p H7.5,在p H8.0和p H9.0条件下处理1h后剩余77.1%和48.5%的相对酶活。同时,该突变体k_(cat)/K_m值达到1229.71 s~(-1)·mg~(-1),催化性能和野生酶相比提高了136.34%。(4)VX-661 IC50关键酸/碱催化残基分别为GLU~(155)和GLU~(259)等的p K_a值较大程度上影响着酶的最适反应p H值,这种作用主要为关键氨基酸的电离状态会与其他带电残基产生静电作用,从而改变蛋白质内部电荷状态。进一步的内部电荷作用力分析和表面电势比较也发现,引入的碱性氨基酸有助于β-1,4-内切葡聚糖酶在碱性环境下稳定性的提高。