磺胺甲恶唑(SMX)是一种人工合成的广谱类抗生素,具有抑菌消炎的作用,广泛应用于临床和兽医领域。然而,SMX的过量使用破坏了生态平衡和环境中的微生物群落结构,也严重危及人类和动物的健康。因此,高效降解环境中的SMX是保证生态安全的迫切需求。生物法去除SMX是目前应用最广、效率最高和最经济实用的方法,其依赖自然选育的SMX降解菌(群)实现对SMX的高效降解。然而,自然选育的菌株存在降解效率低和环境适应能力差等问题。为了进一步提高SMX的生物降解效果,使用代谢工程提高环境微生物降解SMX的效率是一种具有巨大潜力的新策略。然而,由于缺乏环境微生物中的代谢工程改造工具和方法,阻碍了代谢工程改造。为了解决这一问题,本研究以一株具有优异脱氮功效的环境微生物——脱氮副球菌(DYTN-1)为底盘细胞,挖掘并表征了梯度强度启动子,用于调控SMX降解基因簇(sad A、sad B和sad C)的表达水平,同时优化了黄素单核苷酸(FMN)还原酶Laduviglusib使用方法的来源,最终显著提高了P.denitrificans DYTN-1对SMX的降解能力。这是目前国内外首次利用合成生物技术实现强化降解SMX的研究,构建的SMX降解菌株具有同时去除SMX和氮污染物的双重功能,为多重污染的环境修复提供了技术参考。具体研究内容如下:(1)挖掘与表征P.denitrificans DYTN-1的内源性梯度强度启动子。对P.denitrificans DYTN-1的内源启动子进行评估和表征有助于SMX降解基因的优化表达,从而提高降解效果。首先从P.denitrificans DYTN-1基因组上分别克隆了启动子P_(gln A)、P_(nir)、P_(rh O)和P_(cs)。扩增的四种启动子对sf GFP表现出了梯度表达强度,其GFP/OD_(600)表达水平比为10:12:14:17。利用4种内源启动子分别调控sad A、sad B和sad C基因的表达水平,m RNA的表达差异达到2.1-25.3倍,为后续进一步优化SMX降解途径提供了工具。(2)SMX降解途径基因的表达水平优化强化SMX降解。异源基因的过表达对宿主菌的生长代谢都会产生负担,因此系统地优化SMX降解基因的表达水平是提高降解效率和细胞生长的关键。首先,利用筛选的梯度强度启动子P_(gln A)、P_(nir)和P_(cs)对sad A的表达水平进行优化,三种启动子调控下的sad A菌株均对100 mg·L~(-1) SMX的降解效率提高到了18.0%左右,证明Sad A具有降解SMX的作用。由于下游基因sad B未表达引起的代谢限制,中间代谢产物的积累影响了sad A的表达。使用上述梯度强度启动子通过假操纵子结构优化sad A-sad B的表达,发现sad B基因的共表达促进了SMX的降解。较低强度启动子P_(gln A)调控时,sad A和sad B表达的组合优化效果最好,继续提高基因的转录水平反而会降低SMX的降解效率。最终,菌株P_(gln A)-sad A-P_(gln A)-sad B的SMX降解效率最高,达到27.7%。(3)FMN还原酶来源和表达水平优化强化SMX降解。FMNH_2的供应不足可能是限制Sad A和Sad B对SMX降解的主要因素。因此筛选高活性FMN还原酶,并利用梯度强度启动子优化表达水平,有助于进一步提高降解效果。因此,过表达了Sad C及其它五种不同来源的FMN还原酶,进一步提高了SMX的降解效果。除sad C菌株外,其它五种过表达FMN还原酶的菌Wearable biomedical device株中,菌株的降解效率和单位生物量的降解能力随着FMBLZ945体内N还原酶的表达水平增加而增加。通过比对分析酶活和降解效率发现,Cog A、Sad C、Psu K和Sut R过表达的菌株中降解效率随着酶活性的增加而提高。Ssu E和Rut F具有最高酶活,但是其过表达菌株由于表达水平过高,导致SMX的降解效率反而降低。因此,实现代谢调控最优化不仅依靠高酶活,调控元件的适配性也是调控策略的关键因素。最终,构建的最优菌株P.d-p IAB_4-P_(cs)-sut R对SMX的降解效率提高到了44.0%(17.0 mg·(L·OD_(600))~(-1))。(4)P.denitrificans DYTN-1同时降解SMX和氮素的性能研究。为了研究SMX和SMX降解基因对P.dentirificans DYTN-1的硝化和反硝化的影响,测试了其对100 mg·L~(-1) SMX和1 g·L~(-1) NO_3~-(或NH_4~+)的共降解能力。研究发现,野生型菌株的反硝化作用在早期生长阶段受到SMX的抑制,而表达SMX降解基因的重组菌株缓解了这一现象。相比之下,P.dentirificans DYTN-1的硝化过程则完全不受SMX或sad AB-fmn R表达的影响,添加或不添加SMX的野生型菌株对NH_4~+去除率分别为69.5%和67.8%,表达SMX降解基因的菌株NH_4~+去除率也在67.9-71.2%。最终,构建的新菌株适用于SMX和氨氮污染物的双重降解,且去除效率分别达到44.0%和71.2%。