目的:为探究具有抗衰老活性最佳的人参-茯苓药对最佳配比,最佳提取方式,基于酿酒酵母体系为模型开展筛选,从抗氧化应激及能量代谢角度对其活性和作用机制进行初步研究。在筛选出抗衰老活性最佳的人参-茯苓配伍后,采用高效液相色谱技术建立人参-茯苓指纹图谱,并对其共有成分进行含量测定,分析谱效关系。探索人参-茯苓药对对脾虚衰老大鼠抗衰老作用研究;对人参-茯苓药对对衰老大鼠脾脏基质生态位保护机制进行初步探究。方法:1.人参-茯苓药对抗衰老活性条件筛选及机制研究以酿酒酵母做为模式生物,用MTT法绘制酵母的生长曲线,确定生长周期;对配伍比例,给药浓度及给药时间进行筛选。比色法检测酵母细胞内的抗氧化相关的酶活性,ROS,MDA含量。利用扫描电镜观察酵母细胞形态,平板点样法进行抗性实验。采用流式细胞技术检测MMP的变化。实时荧光定量PCR法对酿酒酵母的抗氧化和能量代谢相关基因表达水平进行检测。2.人参-茯苓药对抗衰老成分分析及谱效关系研究利用HPLC法对10批次的人参-茯苓色谱条件进行优化并完成方法学考察,建立HPLC指纹图谱,将指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件”对指纹图谱的相似性进行评价,利用高效液相色谱法对筛选出的人参-茯苓药对最佳配比进行成分分析,对指认出的成分进行含量测定,比较不同批次样品差异成分。采用谱效关系研究方法,进行相关性分析,分析抗氧化活性与特征成分的关系。3.人参-茯苓药对对脾虚衰老大鼠抗衰老作用研究采用D-半乳糖联合不规律饮食构建脾胃衰老模型,记录大鼠外在行为表征、大鼠体重变化。通过行为学试验、脏器指数、Elisa检测血清生化指标、HE染色分析脾脏病理形态、β-半乳糖苷酶染色分析阳性细胞比例,对人参-茯苓药对最佳配比提取物进行抗衰老药效评价。4.人参-茯苓药对对脾脏基质生态位调节作用及机制研究建立过氧化氢(H2O2)诱导细胞损伤模型,采用CCK-8法筛选诱导Raw264.7及3T3-L1氧化应激的适宜浓度。CCK-8法确认对3T3-L1细胞增殖具有促进作用的人参-茯苓core biopsy药对适宜浓度;Elisa测定给药前后Raw264.7细胞内抗氧化酶活性及ROS、MDA含量的变化;采CL 318952试剂用中性红染色法测定Raw264.7细胞吞噬能力的变化;采用Western blot检测人参-茯苓对脾组织和Raw264.7细胞中铁代谢相关蛋白HO-1、VCAM1和SLC40A1,吞噬能力相关蛋白CD163以及CSF1和3T3-L1细胞WT1的表达的影响。扫描电镜观察人参-茯苓对对脾超微结构影响,普鲁士蓝染色分析人参-茯苓对对脾铁代谢功能影响。免疫荧光分析人参-茯苓对F4/80、WT1表达量及红髓网状结构的影响。结果:1.人参-茯苓药对抗衰老活性条件筛选及机制研究经筛选,人参-茯苓1:4水提物的抗衰老能力优于其他配比,且确定给药浓度为220μg/m L,给药时间为28h。人参-茯苓1:4水提物可以显著增强酿酒酵母的SOD、CAT、POD抗氧化相关的酶活性,降低ROS、MDA含量。经流式细胞术检测,人参-茯苓1:4水提物能有效减弱线粒体膜电位的下降趋势,同时可显著提高酵母细胞中的ATP含量。在q PCR水平上,人参-茯苓1:4水提物对酿酒酵母的抗氧化相关基因具有显著下调基因SOD1,上调GSH1和CTT1基因表达;对能量代谢途相关基因有显著下调ATP1和CDC19,上调MRS1基因表达。根据电镜图可清晰看出人参-茯苓1:4水提物对酵母细胞的抗衰老作用,根据抗性试验结果显示人参-茯苓1:4水提物可以提升酵母面对环境胁迫的生长能力。2.人参-茯苓药对抗衰老成分分析及谱效关系研究利用HPLC法,对方法学进行考查,得出精密度,稳定性,重复性共有峰相对保留时间RSD<1%,相对峰面积的RSD<3%。建立10批人参-茯苓1:4水提物指纹图谱,各批次间相似度均>0.900,表明相似度良好。对指认出的共有峰进行含量测定,计算其含量。通过相关性分析,不同批次样品指纹图谱共有峰面积和抗氧化活性之间有良好的线性关系,而人参皂苷Rg1、Rb1、Rg3、茯苓酸具有较显著的抗氧化活性相关系数。3.人参-茯苓药对脾虚衰老大鼠脾胃功能的保护研究人参-茯苓1:4水提物可以提高脾虚衰老大鼠体重,增强大鼠的自主活动能力,穿格次数,站立次数,修饰次数均有提高;提高脾脏器官指数,改善衰老所致的脾脏萎缩。通过Elisa检测,人参-茯苓1:4水提物提高大鼠血清中抗氧化酶活力,降低ROS、AGEs、MDA含量,缓解氧化应激;提高大鼠血清中Ig G、IL-2含量,减少TNF-α、IL-6含量,对免疫功能进行调节;可以修复由D-半乳糖引起的脾脏损伤,恢复正常形态,红白髓界线清晰;同时降低衰老阳性细胞比例。4.人参-茯苓药对对脾脏基质生态位调节作用及机制研究人参-茯苓1:4水提物可以增加RAW264.7对中性红的吞噬能力,并提高细胞及脾脏组织中CD163的表达,证明可恢复巨噬细胞吞噬功能。人参-茯苓1:4水提物可以促进3T3-L1细胞增殖,并提高细胞及脾脏组织中WT1的表达,维持成纤维细胞正常功能。人参-茯苓1:4水提物可以避免衰老大鼠脾脏中铁元素堆积,并提高细胞及脾脏组织中VCAM1、HO-1、SLC40A1表达,对脾的铁代谢功能进行调节。同时,改善衰老大鼠脾脏超微结构,恢复脾脏正常内部结构。人参-茯苓1:4水提物还可以增加F4/80及WT1表达,维持脾红髓巨噬细胞与网状成纤维细胞数量及二者结构稳定。结论:通过以酿酒酵母为模式工具开展人参-茯苓药对抗衰老活性筛选,得出活性最佳为人参-茯苓1:4水提物。通过HPLC技术对人参-茯苓1:4水提物进行成分分析,建立指Ubiquitin抑制剂纹图谱,得出对抗衰老活性影响最大的为Rg1、Rb1、Rg3、茯苓酸。人参-茯苓1:4水提物通过缓解氧化应激,提高免疫功能,恢复脾脏正常形态,减少衰老脾细胞来实现抗衰老作用。人参-茯苓1:4水提物通过维持脾红髓巨噬细胞与脾红髓成纤维细胞细胞之间稳定结构,调节巨噬细胞吞噬功能及铁代谢能力避免铁堆积恢复脾的滤血功能,进而实现脾基质生态位的稳态。研究成果明确了人参-茯苓对脾虚衰老大鼠的保护作用,为人参-茯苓相关药物及保健食品开发提供了理论和实验依据。