目的:最新的调查结果显示,目前全球糖尿病总人数已超过5亿,且最主要的以2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者居多。中国目前T2DM的发病率已超过全球平均水平,高达11.6%。糖尿病作为一种常见病及多发病,其并发症广泛累及多个器官,从而造成严重的病变。其中累及到肾脏的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是最常见的并发症之一。糖尿病肾病作为一种慢性肾病,其病理特征包括肾小球硬化、肾小管萎缩及间质纤维化、白细胞浸润等。糖尿病肾病的发病机制复杂多样。到目前为止,对其病因及发病机制的研究仍尚不清楚。支链氨基酸(BCAAs)包括亮氨酸[Leu]、异亮氨酸[Ile]和缬氨酸[Val]。有研究发现支链氨基酸的血液水平与胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病呈正相关。支链氨基酸尤其是亮氨酸长期以来与2型糖尿病的发病相关。亮氨酸除了具有作为合成各类蛋白质的原料这一基本生物学功能外,还能作为信号分子广泛参与细胞内的各种生理或生化代谢过程。据报道,亮氨酸可以通过影响代谢紊乱从而参与糖尿病的发生发展。我们前期的代谢组学发现,在高糖环境下,足细胞中的亮氨酸含量明显增加。由此引发猜想:糖尿病环境下,亮氨酸水平升高是否会引起肾组织损伤,进而影响肾功能,参与糖尿病肾病的发生发展?因此,本研究拟以2型糖尿病小鼠与人肾近端小管上皮细胞(Human Renal Cortex Proximal Tubule Epithelial Cells,HK2)为研究对象,探讨亮氨酸在糖尿病肾病肾组织损伤中的作用,为明确糖尿病肾病的相关病因及发病机制,探索糖尿病肾病的防治方法提供实验依据。方法:1.亮氨酸在2型糖尿病小鼠肾组织损伤及脂质沉积中的作用8周龄的CD-1小鼠(购自维通利华)20只随机分为两组,正常对照组,采用普通饲料喂养;2型糖尿病组,进行高脂饲料喂养(脂含量60%),8周后腹腔连续注射STZ 50mg/kg的三次,诱导2型糖尿病模型。以空腹血糖浓度连续3次检测超过11.1m M确认糖尿病小鼠模型构建成功。正常对照组小鼠注射等量的溶媒(0.1m M柠檬酸缓冲液,PH值为4.5)。造模成功后,正常组及2型糖尿病组小鼠随机分正常饮水组和亮氨酸组。亮氨酸组以饮水中添加1.5%的亮氨酸喂养。喂养四周后,收集小鼠24h尿,处死动物取血、肾组织。肾组织取材分成三部分,包括石蜡、冰冻以及新鲜组织。1.1亮氨酸对2型糖尿病小鼠生化指标的影响南京建成检测试剂盒检测小鼠24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮的含量。统计学分析。中生北控试剂盒检测血甘油三酯、胆固醇、组织游离脂肪酸的含量。1.2亮氨酸在2型糖尿病小鼠肾小球损伤中的作用过碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain,PAS)观察小鼠肾小球形态学的改变,免疫组织化学技术(immunohistochwww.selleck.cn/products/lee011emistry,IHC)检测肾小球足细胞标志物Nephrin、Synaptopodin的表达,蛋白质印迹(Western blot)检测足细胞标志物nephrin蛋白的表达。1.3亮氨酸在2型糖尿病小鼠肾小管上皮细胞脂质沉积以及EMT中的作用。⑴亮氨酸在2型糖尿病小鼠肾小管上皮细胞脂质沉积中的作用。油红O染色检测肾组织内脂质沉积情况,免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测脂代谢相关指标ADRP、SREBP-1的表达,western blot检测脂代谢相关指标ADRP、SREBP-1蛋白的表达。⑵亮氨酸在2型糖尿病小鼠EMT及巨噬细胞浸润中的作用。免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测EMT相关指标FN、E-Cadherin、α-SMA、Vimentin、CD68的表达,蛋白质印迹(Western blot)检测FN、E-Cadherin、α-SMA、Vimentin蛋白的表达。2.亮氨酸在人肾小管上皮细胞脂代谢及EMT中的作用。将人肾小管上皮细胞(HK2)分为对照组(control)、亮氨酸组(Leu)、高糖组(HG)、高糖加亮氨酸组(HG+Leu)以及高糖去亮氨酸组(HG-Leu)。待细胞融合60%时分别加亮氨酸和高糖刺激,孵育48h后收集细胞。Western blot检测EMT相关指标FN、E-Cadherin、α-SMA、Vimentin,脂代谢相关指标ADRP、SREBP-1蛋白的表达。油红O染色检测不同浓度以及不同时间的亮氨酸刺激下肾小管上皮细胞脂质沉积的情况。3.统计学分析实验结果采用SPSS21.0统计分析软件进行数据处理,正态分布的计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,两组间数据比较采用t检验,多组间比较采用方差分析,不符合正态分布的计量资料采用Wilcoxon秩和检验,P<0.05具有统计学义。结果:1.亮氨酸加重正常及2型糖尿病小鼠肾组织损伤及脂质的沉积1.1亮氨酸加重2型糖尿病小鼠血、尿生化肾功能相关指标24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮,在正常组及2型糖尿病组中加入亮氨酸后均增加(P<0.05),说明亮氨酸加重了蛋白尿及肾功能损伤。血脂相关指标血清甘油三酯、胆固醇和组织游离脂肪酸的含量在加入亮氨酸后均增加(P<0.05),说明亮氨酸会加重血脂升高,进而导致血脂的紊乱。1.2亮氨酸加重正常selleck及2型糖尿病小鼠基质沉积及足细胞损伤⑴PAS染色显示正常对照组肾小球基底膜突出,肾小球血管袢薄而清晰,呈红色。在正常对照组和2型糖尿病组中,加入亮氨酸后肾组织中肾小球系膜区显著增宽,ECStructural systems biologyM沉积明显增加,基底膜(glomerular basement membrane,GBM)增厚。⑵IHC结果显示正常对照组肾小球足细胞标志物Nephrin、Synaptopodin表达位置位于足细胞,表达量丰富。2型糖尿病组肾小球足细胞标志物Nephrin、Synaptopodin表达位置位于足细胞,表达量较少。在正常对照组和2型糖尿病组,加入亮氨酸后肾组织中肾小球足细胞标志物Nephrin、Synaptopodin表达明显降低(P<0.01),Western blot检测结果发现在加入亮氨酸后足细胞标志物nephrin的蛋白表达明显降低(P<0.05)。1.3亮氨酸加重正常及2型糖尿病小鼠肾小管上皮细胞脂质沉积以及上皮间充质转化。⑴亮氨酸加重正常及2型糖尿病小鼠肾小管上皮细胞脂质沉积。(1)油红O染色发现:正常小鼠肾组织内几乎无脂滴沉积,亮氨酸组有少量脂滴沉积,2型糖尿病组有多量细小脂滴沉积,2型糖尿病加亮氨酸组有大量较大脂滴弥漫分布。(2)免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测正常对照组脂代谢相关指标ADRP、SREBP-1无明显表达,2型糖尿病组中表达位置位于肾小管,表达量丰富,在加入亮氨酸后表达进一步增加,Western blot检测脂代谢相关指标ADRP、SREBP-1蛋白水平在加入亮氨酸后表达增加(P<0.05),与免疫组化结果一致。⑵亮氨酸加重正常及2型糖尿病小鼠上皮间充质转化及炎性细胞浸润。(1)免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测结果显示:与正常及2型糖尿病组比,在加入亮氨酸后EMT相关指标FN、α-SMA、Vimentin,巨噬细胞标志物CD68的表达增加(P<0.05),E-Cadherin表达降低(P<0.05)。(2)Western blot检测结果显示:与正常及2型糖尿病组小鼠比,在加入亮氨酸喂养小鼠后EMT相关指标FN、α-SMA、Vimentin的蛋白表达增加(P<0.05),E-Cadherin的蛋白表达降低(P<0.05)。2.亮氨酸加重人近端肾小管上皮细胞脂质沉积及上皮间充质转化。(1)油红O结果显示:在正常组及高糖刺激组加入不同的亮氨酸,发现在不同浓度亮氨酸刺激下,随着浓度的增加,肾小管上皮细胞脂质的含量明显增加(P<0.05)。在高糖的环境下,随着亮氨酸浓度的增加,肾小管上皮细胞脂质含量也是明显增加的。但在高糖条件下去除亮氨酸,脂质的含量明显降低(P<0.05)。与正常组相比,随着时间的延长(12h、24h、48h),亮氨酸组脂质含量明显增加。与高糖组相比,高糖加亮氨酸组随着时间的延长,脂质含量也是明显增加的(P<0.05)。(2)Western的结果显示无论在正常组以及高糖组中,加入亮氨酸FN的表达都是增加的,高糖去除亮氨酸组FN的表达明显降低(P<0.05)。脂代谢相关指标SREBP-1,ADRP的蛋白表达都是增加的,高糖去除亮氨酸组蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论:1.亮氨酸加重糖尿病小鼠肾组织损伤,促进肾小球内基质沉积及足细胞损伤。2.亮氨酸促进肾小管上皮细胞内脂质沉积及上皮间质转分化,参与肾间质纤维化的发生。