背景及目的:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤,2020年,结直肠癌发病率Puromycin为10.0%,约193万例,是全球癌症相关死亡率的第二大原因。临床上5-FU是治疗结直肠癌患者的一线化疗药物,据调查统计:结直肠癌患者长期使用含5-FU辅助化疗药物后,约50%的晚期患者对5-FU及其代谢物耐药。5-FU发挥抗癌作用的疗效仅有10%-17%,细胞内5-FU暴露浓度降低是造成疗效下降且肿瘤细胞获得化学抗性的原因之一。因此,需开发多种联合治疗方案,提高其治疗效果并降低其毒性。基于课题组前期文献调研,五味子乙素与抗肿瘤药物联用,具有增效减毒的作用。本课题研究五味子乙素增加5-FU在结直肠癌细胞内的暴露水平,协同5-FU抗结直肠癌作用的机制。方法:首先,采用CCK-8实验考察5-FU、五味子乙素及两药联用对结直肠癌细胞系(Caco-2、HT-29、SW480)、原代结直肠癌细胞增殖的影响;Tunel细胞凋亡实验研究5-FU、五味子乙素及两药联用对HCT116细胞凋亡的影响。其次,为研究五味子乙素增加5-FU在结直肠癌细胞内的暴露水平。采用Bioelectricity generationRT-PCR实验研究五味子乙素对ABC家族外排转运体的影响;采用非靶向代谢组学实验定量五味子乙素处理的HCT116细胞内代谢小分子及ABC外排转运体内源性底物变化;采用Western blot实验验证五味子乙素对ABC外排转运体表达的影响。进一步研究五味子乙素对ABCC2、ABCC5和ABCC11转运体的影响,采用腺病毒转染实验使ABCC2、ABCC5和ABCC11蛋白高表达;Western blot实验研究五味子乙素对过表达ABCC2、ABCC5和ABCC11蛋白的影响、CCK-8实验考察五味子乙素联合5-FU对过表达ABCC5和ABCC11细胞增殖的影响及过表达ABCC5和ABCC11细胞内5-FU的浓度变化。然后,建立并验证一种直接、灵敏、有效的LC-MS/MS测定HCT116细胞内五味子乙素浓度检测方法,探讨五味子乙素在细胞中的浓度空间分布。前处理方法:经样品/含内标的甲醇(1:3)沉淀蛋白后进样分析。色谱条件:Atlantis(?)T3-C18色谱柱(2.1*100 mm,3μm);流动相:水(含0.2%甲酸)-甲醇,梯度洗脱程序为:0 min,0%B;0-0.5 min,0%-90%B;0.51-53 min,100%B。流速为0.4 m L/min,进样量为5μL。质谱条件:ESI离子源,正离子模式下进行检测,多反应监测模式(MRM)。最后,采用转录组学实验研究五味子乙素抑制结直肠癌细胞ABCC2、ABCC5和ABCC11转运体靶点的探索,研究Sch.B抑制ABC转运体的分子机制。结果:首先,CCK-8实验结果发现,与对照组或单独给药组相比,五味子乙素联用5-FU显著抑制结直肠癌细胞系(Caco-2、HT-29、SW480)和原代结直肠癌细胞的增殖;Tunel细胞凋亡实验结果表明了五味子乙素增强了5-FU促进HCT116细胞凋亡的作用Galunisertib半抑制浓度。其次,通过研究五味子乙素增加5-FU在结直肠癌细胞内的暴露水平,RT-PCR实验结果发现五味子乙素抑制ABCC2、ABCC5和ABCC11蛋白mRNA的表达;非靶向代谢组学结果发现五味子乙素抑制ABCC11蛋白的表达,进而抑制白三烯代谢物的外排,使白三烯代谢物在胞内的蓄积;进一步研究五味子乙素对ABCC2、ABCC5和ABCC11转运体的影响,RT-PCR和Western blot实验结果验证ABCC2、ABCC5和ABCC11蛋白的高表达;CCK-8实验发现5-FU合用五味子乙素可抑制表达ABCC5和ABCC11细胞的增殖;LC-MS/MS定量细胞内5-FU浓度水平结果显示,五味子乙素抑制ABCC11的表达,使胞内5-FU浓度蓄积。然后,针对LC-MS/MS建立的五味子乙素测定方法结果表明,五味子乙素在20-1000 ng/m L范围内线性关系良好,方法学验证都符合要求。最后,转录组实验结果发现在Sch.B药物处理后,分别有ABCC2、ABCC5和ABCC11等20个基因和CCN2、PLPPR3等26个基因显著下调和上调;GO富集分析显示谷胱甘肽跨膜转运和白三烯B4代谢过程被显著抑制且下调;对差异表达基因进行GO level2和KEGG通路富集显示:差异表达的基因在转运体通路中被富集且转运体的活性被显著抑制。结论:5-FU联合五味子乙素可显著抑制结直肠癌细胞系(Caco-2、HT-29、SW480)和原代结直肠癌细胞的增殖并且促进凋亡。其次,研究五味子乙素增加5-FU在结直肠癌细胞内的暴露水平结果表明五味子乙素显著抑制ABCC2、ABCC5和ABCC11蛋白mRNA的表达,五味子乙素抑制ABCC11蛋白的外排作用,使其特异性的内源性底物白三烯代谢物外排作用减弱,造成胞内白三烯代谢物蓄积。进一步研究五味子乙素对ABCC2、ABCC5和ABCC11转运体的影响发现五味子乙素显著抑制ABCC2、ABCC5和ABCC11蛋白的高表达,抑制ABCC5和ABCC11蛋白表达增强5-FU抑制HCT116细胞的增殖及抑制5-FU药物流出细胞,提高其在细胞内的暴露浓度,增强抗结直肠癌作用。然后,建立了一种简便、快速、灵敏的UHPLC-MS/MS测定细胞中五味子乙素浓度的方法。发现五味子乙素在细胞核的空间分布表现时间上的差异,这可能有助于研究Sch.B对癌细胞的作用。最后,通过转录组学实验研究五味子乙素抑制结直肠癌细胞ABCC2、ABCC5和ABCC11转运体靶点的探索结果表明HCT116细胞内共有260和73个基因被上调和下调。Sch.B处理后,分别有20和26个差异表达基因被显著下调和上调;Sch.B通过抑制转运体通路的活性,抑制ABCC2、ABCC5和ABCC11转运体的功能,抑制其介导谷胱甘肽跨膜转运和白三烯B4代谢过程。