研究背景:高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia,HTG)和非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)正在逐渐成为全球范围内的流行病,并且他们显著增加动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)、糖尿病、肥胖的发生风险。而非酒精性脂肪肝是以甘油三酯(triglyceride,TG)在肝细胞中蓄积为主要病理特征的一种最常见的慢性肝脏疾病。控制HTG和TG在肝细胞沉积被认为是改善ASCVD、NAFLD和糖尿病预后的重要策略。二甲双胍被推荐为2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)单药治疗的首选药物,二甲双胍在脂质代谢,肿瘤发生和心血管保护方面也呈现出保护性效应。临床研究表明,二甲双胍对改善糖尿病和非糖尿病患者的NAFLD有明显的益处。在二甲双胍介导的脂质和葡萄糖代谢的调节中,腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路起着非常重要的作用。以前的研究表明,AMPK可通过调节固醇调节元件结合蛋白-1c(Sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c)、乙酰辅酶 A 羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,Acc)和硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 1(Stearyl-coenzyme A desaturase 1,Scd1)活性来降低甘油三酯和胆固醇合成。二酰基甘油酰基转移酶 2(Diacylglycerol 0-acyltransferase 2,DGAT2)是肝脏内催化TG合成的最后的关键酶。肝脏过表达DGAT2的小鼠表现出严重的肝胰岛素抵抗和脂肪变性。抑制DGAT2表达已被证明可以改善T2DM大鼠的胰岛素抵抗和肝脂肪变性,这表明DGAT2在T2DM的肝脂肪变性和HTG中起重要作用。X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)作为转录因子可作用于内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激、脂肪细胞分化以及脂肪酸和TG合成过程,而近来研究显示DGAT2是XBP1的一个下游靶基因。目的:本研究的目的是探讨二甲双胍是否是通过调节DGAT2或者XBP1改善肝脏内TG的从头合成,以及是否与AMPK有关,研究结果或可能有助于开发治疗NAFLD的新药物。研究方法:1.体内实验:雄性C57/BL6小鼠分别给予对照饮食(Research Diets D12450)、高脂饮食(high-fat diet,HFGSK1349572价格D)、高脂饮食(HFD)联合二甲双胍(300毫克/千克/天)治疗5周。每周测量小鼠的体重和食物摄入量。2.体外实验:HepG2细胞分别给予不同浓度二甲双胍(2 mmol/L或5mmol/L)、或200 μM棕榈酸、或XBP1小干扰RNA、或显性失活突变型AMPKα 1质粒、或重组过表达XBP1腺病毒处理24小时或48小时。观察DGAT2蛋白变化。3.TG测定:采用甘油-磷酸氧化酶-过氧化物酶法和TG检测试剂盒测定肝脏TG含量。4.实时定量PCR检测XBP1和DGAT2基因的表达。5.蛋白质印迹检测AMPK、XBP1、DGAT2蛋白水平。6.免疫荧光用来检测XBP1在肝细胞中的表达和分布。7.双萤光素酶报告基因检测系统评价DGAT2的转录活性。结果:1.二甲双胍治疗降低小鼠肝脏TG含量为了确定二甲双胍是否影响肝细胞中TG的含量,分别给予对照饮食、HFD、HFD联合二甲双胍喂养小鼠5周。与对照组相比,HFD喂养的小鼠体重显著增加,而二甲双胍治疗的小鼠体重下降。对照组、HFD组和HFD联合二甲双胍组在食物摄取量上没有显著差异。HFD喂养的小鼠肝细胞中TG含量增加,而二甲双胍治疗对HFD喂养的小鼠肝脏中TG的积累有抑制作用。2.二甲双胍降低小鼠肝脏和HepG2细胞中DGAT2的表达HFD喂养小鼠肝脏中包括Fas、Scd1、Acc1、甘油-3-磷酸酰基转移酶1(glycerol-3-phosphate acyltransferase 1,Gpat1)、DGAT2 在内的脂质合成基因表达均显著增加。尽管二甲双胍治疗后导致脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,Fas),Scd1,Acc1和Gpat1表达略有下降,但与HFD组小鼠之间无明显差异。而小鼠肝脏DGAT2的mRNA水平在二甲双胍治疗后显著降低。HFD喂养的小鼠肝脏中DGAT2蛋白水平也显著升高,而二甲双胍治疗抑制了这种升高。为了证实这一medial congruent发现,用不同浓度的二甲双胍刺激HepG2细胞,DGAT2 mRNA水平和荧光素酶活性呈剂量依赖性显著降低。3.二甲双胍降低了肝脏细胞核和细胞质中的XBP1蛋白水平有研究表明,XBP1是DGAT2的上游调控因子。已经鉴定出XBP1的两种亚型,包括非剪切(unspliced form,XBP1u)和剪切(spliced form,XBP1s)形式,XBP-1u形式在应激条件下经过非常规细胞质剪切处理转化为XBP-1s,XBP-1s转位进入细胞核成为活性转录因子。用能识别两种XBP1亚型的抗XBP1抗体,我们分析了二甲双胍治疗后小鼠和HepG2细胞核和细胞浆XBP1蛋白的表达。HFD喂养的小鼠肝脏中XBP1 mRNA增加,而二甲双胍的处理降低了 XBP1的mRNA水平。在HFD喂养小鼠的肝脏中,细胞核和细胞质的XBP1蛋白水平也显著增加,但二甲双胍治疗减轻了这种影响。与体内实验数据一致,在体外二甲双胍刺激的HepG2细胞中,细胞核和细胞质中XBP1表达呈明显的剂量依赖性下降。4.二甲双胍通过调节XBP1介导的DGAT2表达减少TG合成为了检测XBP1对DGAT2表达的调控作用,将XBP1 siRNA转染HepG2细胞。与对照siRNA转染组及对照组细胞相比,XBP1 siRNA转染组DGAT2蛋白和mRNA水平下降。DGAT2荧光素酶基因检测结果支持上述结果。经XBP1 siRNA处理的HepG2细胞与经二甲双胍和XBP1 siRNA处理的细胞比较,肝脏TG含量LGX818采购无显著差异。为了进一步探索XBP1在二甲双胍通过调控DGAT2影响TG合成中的作用,用2 mmol/L二甲双胍,或200 μM棕榈酸(PA)联合或不联合二甲双胍处理XBP1敲除的AML12肝细胞48小时。PA孵育肝细胞后TG含量显著增加,但二甲双胍处理对PA孵育后XBP1敲除AML12肝细胞的TG含量没有影响。此外,当PA处理时,XBP1敲除AML12肝细胞中的DGAT2蛋白显著增加,二甲双胍治疗对DGAT2发挥轻度抑制作用,但未能完全抑制PA诱导的DGAT2蛋白增加。5.二甲双胍通过XBP1介导的DGAT2通路影响TG合成涉及AMPK对照饮食、HFD、HFD联合二甲双胍喂养小鼠5周,结果显示总AMPK蛋白水平在对照组、HFD组和HFD联合二甲双胍组没有明显差异。HFD喂养小鼠肝脏中磷酸化AMPK(p-AMPK)水平明显降低,而二甲双胍增加小鼠和HepG2细胞p-AMPK水平,激活AMPK活性。为了验证AMPK活性对XBP1和DGAT2表达的影响,用过表达显性失活突变型AMPK质粒(DN-AMPK α 1)转染HepG2细胞48小时。抑制AMPK的活性导致HepG2细胞XBP1和DGAT2表达上调。免疫荧光显示DN-AMPK增强XBP1蛋白表达,二甲双胍可减弱这种变化。通过抑制AMPK活性,DGAT2蛋白水平也增加,二甲双胍也抑制了这种作用。为了进一步确定AMPK活化是否参与二甲双胍调节XBP1/DGAT2通路,将DN-AMPK质粒与过表达XBP1的重组腺病毒(Ad XBP1)共转染HepG2细胞。二甲双胍治疗后,DGAT2蛋白水平明显减少,过表达XBP1和AMPK失活显著增加DGAT2蛋白水平。结论:1.二甲双胍可降低DGAT2表达和肝脏TG的合成。2.二甲双胍激活AMPK通路抑制XBP1/DGAT2介导的TG合成。3.XBP1可能是二甲双胍调节肝脏TG合成的一个新的代谢介质。