光动力疗法(PDT)是一种具有微创、高生物安全性的组合治疗方法,已经在生物医学领域得到了广泛关注。然而,由于PDT治疗所依赖的光敏剂(PS)大多都具有疏水性,在体内很容易发生聚集和淬灭,严重降低了 PS的利用效率和PDT的治疗效果。蛋白酶是生物新陈代谢的主要成分,具有良好的生物相容性和高催化活性,可作为一种理想的光敏剂载体,实现催化增强的PDT治疗。但是,使用常规的化学偶联方法实现蛋白酶与PS分子的结合往往会削弱蛋白酶的生物活性,从而影响其实际应用效果。发展高效PS输送的新理论、新方法、新结构是生物医学应用的迫切需要,也是基础研究的重要科学问题。因此,我们提出可以通过物理吸附的方法,依靠蛋白酶与光敏剂之间的非共价相互作用(氢键、静电相互作用、π-π堆叠和范德华相互作用等)实现光敏剂与蛋白酶之间的组装,这样不仅可以实现光敏剂的负载,同时也避免了化学修饰对蛋白酶稳定性和生物活性的不良影响。基于此,本论文首先通过分子动力学模拟的方法,详细地研究了过氧化氢酶(CAT)、葡萄糖氧化酶(GOx)和溶菌酶(LZ)三种蛋白酶的二级结构对光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)的结合倾向性,并在此基础上发展了一种普适的蛋白酶纳米光敏剂的合成策略,且系统探讨了其在抗菌应用领域的PDT治疗效果。本论文的主要研究内容和成果如下:1.通过分子动力学模拟的方法,系统地研究了 Ce6分子与过氧化氢酶(CAT)、葡萄糖氧化酶(GOx)、溶菌酶(LZ)三种蛋白酶的相互作用机制和结合过程。模拟结果表明,三种蛋白酶均可以和小分子发生相互作用并结合,且发现蛋白酶的螺旋(Helix)结构要比β-折叠(β-sheet)结构更容易与小分子发生相互作用,这可能与Helix结构可以和Ce6分子形成更多的氢键有关。为了进一步验证Helix结构与Ce6的结合倾向性,我们分别选取了仅包含Helix结构域的HP35蛋白和仅包含β-sheet结构域的aβ42蛋白进行了更加深入的研究。通过Ce6分子与两种蛋白的结合位置演变,我们发现与aβ42蛋白相比,Ce6分子和HP35蛋白显示出更高的结合概率,这进一步验证了我们之前的结论。同时,我们还发现,Ce6分子与蛋白酶之间的静电相互作用也会对它们之间的结寻找更多合产生一定的影响。模拟结果显示,分布在蛋白酶表面的正电荷区域越多,Ce6分子便越有可能与蛋白酶相结合。2.基于蛋白酶Helix结构域与Ce6的结合倾向性,我们发展了一种制备蛋白酶纳米光敏剂的普适性策略。在聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的作用下,CAT、GOx、LZ三种蛋白酶均可与Ce6稳定结合并形成蛋白酶纳米光敏剂CAT-Ce6 NPs、GOx-Ce6 NPs和LZ-Ce6 NPs。实验表明,所形成的蛋白酶纳米光敏剂具有良好的生物相容性,且Ce6的负载和PVP的包覆可以进一步提高蛋白酶的稳定性。催化实验表明,所制备的三种蛋白酶纳米光敏剂分别具有显著的CAT、GOx、LZ催化活性,说明Ce6的负载和PVP的包覆并没有对相应蛋白酶的催化能力造成影响。3.为了考察所制备的蛋白酶纳米光敏剂的PDT效果,我们以金黄色葡萄球菌为研究对象,对CAT-Ce6 NPs的PDT抗菌效果进行了评估。通过细菌形态学研究发现,CAT-Ce6NPs可以有效地破坏细菌的细胞壁和细胞膜,具有优异的光动力抗菌效果。通过模拟细菌感MEK抑制剂染微环境,我们证实了 CAT-Ce6 NPs可以通过分解环境中的过氧化氢(H2O2)为光动力疗法提供氧气(O2),从而有效改善乏氧微环境并增Glycopeptide antibiotics强PDT的抗菌效果。动物活体实验表明,CAT-Ce6NPs可以有效缓解小鼠细菌感染(皮下脓肿模型)的乏氧微环境,进而提升PDT抗菌效果,实现脓肿的有效快速治疗。综上所述,通过系统探索蛋白酶与光敏剂之间的物理相互作用,我们实现了蛋白酶纳米光敏剂的可控组装和增强的PDT抗菌效果。本论文的研究成果不仅有助于蛋白光敏剂功能的预测和调控,而且对高生物相容性和丰富生物学功能的智能纳米光敏剂的设计和开发具有理论指导意义。