日本蟳(Charybdis japonica)隶属于十足目(Decapoda),梭子蟹科(Poratunidae),蟳属(Charybdis),是重要的海洋经济蟹类。目前开展了形态学、渔业生物学、种质资源学、群体遗传学等研究,而表观遗传学的研究尚未见报道。表观遗传修饰具有代际遗传性,能够在环境胁迫下产生特定的应答,用DNA甲基化等形式将应激的模式记录在遗传修饰中,对基因表达产生适应性、短期或长期的表型可塑性,并增加适应环境的潜力,或缓冲生物体免受有害环境的影响。热休medicinal plant克蛋白(heat shock protein,Hsp)在细胞过程和对环境应激的反应中发挥着关键作用。特别是在维持细胞稳态、转运和参与信号转导过程中的作用,直接影响着蟹类的行为、生理、适应反应和调节机制。Hsps中研究最广泛的基因家族是Hsp70、Hsp40基因家族,对于蟹类应对复杂多变的潮间带生活,尤其是温度的波动,具有重要的作用。本研究选取不同水温条件下5个南北群体(台州、舟山、连云港、烟台、大连)25个个体的日本蟳样品,进行全基因组的甲基化测序,获得群体间和个体间的差异表达的甲基化区域,以及差异甲基化基因与其对应的功能注释和信号通路,得到了较高水平的组装和注释信息;其次,采用生物信息学的方法,对日本蟳的Hsp70和Hsp40基因家族进行全基因组鉴定分析,同时利用转录组测序得到的基因表达量数据进行联合分析,得到不同群体之间差异表达基因,分析差异表达基因的DNA甲基化情况,比较不同群体之间Hsps基因甲基化水平的差异,分析DNA甲基化在不同群体温度适应中的贡献,解析了日本蟳表观遗传学差异的遗传基础。该研究结果从表观调控水平和转录组水平阐明不同群体温度适应机制,为Hsp70和Hsp40基因参与温度选择压力下日本蟳南北群体表观遗传差异提供初步的理论参考,也为十足目类的表观遗传学研究提供基础数据。主要研究结果如下:1、日本蟳不同群体的全基因组甲基化测序分析本研究结合亚硫酸氢盐转化方法与二代测序技术,得到1474.58G总的原始数据,1386.04G总的有效数据,平均测序深度为41.25x。在日本蟳基因中所有染色体平均甲基化的CpG的比例(mCpG%)为21.57%,其中甲基化的CHG、CHH的比例分别为0.42%和0.43%,整体甲基化的胞嘧啶的平均比例为3.23%。25个样品三种胞嘧啶类型(CHG、CHH、CpG)的DNA甲基化水平和分布模式,其中CHG和CHH的甲基化变化水平整体相似,不管是TSS上游2kb还是至TES下游2kb的甲基化水平都呈现较低水平。在CpG甲基化水平中,在TSS附近和基因下游的甲基化水平维持在高甲基化,基因区的甲基化水平存在波动现象。本研究以海州湾为界,把连云港群体作为参考群体,分别对台州、舟山、烟台和大连群体分组进行差异比较,发现不同群体之间的差异甲基化区域(DMRs,differentially methylated regions)数量存在差异,既有高甲基化又有低甲基化的DMRs,并且不同群体不同基因结构之间的超甲基化和低甲基化也不同。日本蟳不同群体的功能富集也存在差异,各群体主要富集在G-蛋白偶联受体信号通路(GO:0007186)、角质层的结构成分(GO:0042302)、突触组织(GO:0050808)、内质网(GO:0005783)、细胞外空隙(GO:0005615)、核酸酶的活性(GO:0004518)、RNA聚合酶Ⅱ的转录负调控(GO:0000122)等通路中。各群体KEGG通路主要与嘧啶代谢(ko240)、RNA 聚合酶(ko3020)、DNA 复制(ko3030)、过氧化酶体(ko4146)、甘油磷脂质代谢(ko564)、PPAR信号通路(ko3320)等通路相关。在www.selleck.cn/products/byl719RNA聚合酶通路中,涉及RPABC4、RPB12、RPABC5、RPC8等基因,在嘧啶代谢通路中,涉及ndk、NME、ENPP1_3、CD203等基因,过氧化物酶体通路中,涉及PECR、PXMP2、RMP22基因,在DNA复制通路中,涉及POLA2、POLE、PRI1、PRI2、POLE4基因。2、日本蟳Hsp70基因家族的鉴定及其基因表达量和甲基化数据的联合分析本研究从日本蟳全基因组序列中鉴定得到Hsp70基因家族,并对鉴定得到的22个hsp70基因序列特征、编码蛋白的结构和系统发育分析开展了初步的探究。日本蟳的22个hsp70基因可归为四个亚家族,其中Hspa9亚家族中有16个成员(hspa9-hspa9l.15),Hspa8亚家族中有4个成员(hspa8l.1-hspa8l.4),可能表明甲壳类特有的基因扩增,另外hsph1属于Hsphl亚家族,hspa5属于Hspa5亚家族。Hsp70基因CDS长度为1389～2769bp,编码蛋白长度为462～922个氨基酸(aa)。选择压力分析表明5对Hsp70同源基因对Ka/Ks值均小于1.0,说明该基因在进化过程中经历了高度纯化选择。不同南北群体中共找到5个差异甲基化基因:hspa8l.1、hspa8l.2、hspaSl.3、hsph1、hspa9,并且5个差异甲基化基因在各群体中有4个基因差异表达。功能富集分析主要富集到9个GO通路,4个KEGG通路。在台州和烟台群体中,hspa8l.1和hspa8l.2显著下调;舟山和大连群体中,只有hspa8l.1显著下调;另外在各群体中没有显著上调的基因。3、日本蟳Hsp40基因家族的鉴定及其基因表达量和甲基化数据的联合分析本研究从日本蟳全基因组序列中鉴定得到47个DNAJ基因,包括9个DNAJA亚家族成员,8个DNAJB亚家族成员,30个DNAJC亚家族成员。DNAJ基因的编码序列长度为357～2421 bp,编码蛋白长度为118～806 aa。选择压Compound C体内力分析表明日本蟳DNAJ亚家族的扩展基因对的Ka/Ks比值小于1.0,表明经历明显的负选择压力。对日本蟳 DNAJ基因家族进行了很好的初步分类,这是功能鉴定的重要一步,为日本蟳DNAJ基因家族对环境胁迫的调控机制以及进化研究提供新的见解。在Hsp40基因家族中共有DNAJC25、DNAJB11L.L、DNAJA1L三个Hsp40基因家族成员是差异甲基化基因。功能富集分析主要富集到7个GO通路,未富集到的KEGG通路。在5个群体中,只发现DNAJB11L、DNAJC7L、DNAJC2三个Hsp40基因差异表达。DNAJB11L在各群体中均显著表达,DNAJC7L在台州和舟山群体显著下调,DNAJC2在舟山群体中显著下调。