背景与目的:外周T细胞淋巴瘤(Peripheral T cell lymphomas,PTCL)是侵袭性疾病,被定义为一组由成熟T细胞或NK细胞引起的异质性淋巴增生性疾病,目前,患者生存期短,治疗进展缓慢,虽然近来临床上利用CD30单抗及PI3K抑制剂取得了一定的疗效,但治疗效果仍不尽人意。为此,深入了解PTCL发病的分子发病机制,优化其治疗手段及研发治疗药物,是目前临床亟待解决的重点课题。Micro RNAs(miRNAs)是一类非编码的小RNA,可在转录后水平导致m RNA降解或翻译抑制,进而调控下游基因的表达。已有相关研究认为,miRNAs的异常表达参与PTCL的进展,影响患者的生存,可作为PTCL的潜在诊断及治疗靶点。miR-3196在多种肿瘤中均起到肿瘤抑制因子的作用,抑制肿瘤的进展,但miR-3196在PTCL中的作用,尚不明确。丙戊酸(VPA)是一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂,已被提议用于治疗NHL。然而,关于VPA在淋巴瘤中的抑制作用及其机制研究是有限的。本研究拟明确丙戊酸对PTCL细胞增殖的作用及其与miR-3196表达的关系。第一部分VPA通过miR-3196对外周T细胞淋巴瘤细胞的增殖效应的影响目的:检测VPA对PTCL细胞增殖的影响及其与miR-3196表达的相关性。方法:1、CCK8法检测VPA对Hut 78及A3细胞增殖的影响。2、q RTPCR检测VPA干预后,Hut 78及A3细胞中miR-3196表达变化。3、利用脂质体,分别将miR-3196 mimics、miR-3196 inhibitor、miR-3196 NC转染入Hut 78及A3细胞,VPA干预24h后,CCK-8检测细胞点击此处增殖能力变化;Annexin VFITC/PI双染检测细胞凋亡变化;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白(Bad、Bcl-2、Cleaved Caspase-3)及PI3K/Akt通路蛋白表达;生化试剂盒检测分析ATP、乳酸及糖摄取改变;流式细胞术检测ROS水平。结果:1、与Control组相比,VPA组(0 m M、0.5 m M、1 m M、2 m M、4 m M、8m M、16 m M、32 m M)可显著抑制Hut 78及A3细胞增殖率(P<0.01)。2、与Control组相比,VPA组(8 m M、16 m M、32 m M)可显著促进Hut 78及A3细胞中miR-3196的表达,其中16 m M的VPA最明显(P<0.01)。3、与Control组比较,VPA及miR-3196 mimics可显著抑制Hut 78及A3细胞增殖(P<0.01),促进Hut 78及A3细胞凋亡(P<0.01),促进Bad及Cleaved caspase-3蛋白的表达(P<0.01),抑制Bcl-2蛋白的表达(P<0.01);而miR-3196 inhibitor可显著促进Hut 78及A3细胞增殖(P<0.01),抑制细胞凋亡(P<0.01),显著抑制Bad及Cleaved caspase-3蛋白的表达(P<0.01),促进Bcl-2蛋白的表达(P<0.01);而与miR-3196 mimics联合,VPA可进一步促进细胞凋亡(P<0.01),促进Bad及Cleaved caspase-3蛋白的表达(P<0.01),抑制Bcl-2蛋白的表达(P<0.01)。4、与Control组比较,VPA及miR-3196 mimics可显著促进Hut 78及A3细胞糖摄取(P<0.01)、ROS含量(P<0.01)、乳酸含量(P<0.01),抑制ATP含量(P<0.01);miR-3196 inhibitor可显著抑制Hut 78及A3细胞中ROS含量、细胞糖摄取及乳酸含量(P<0.01)、促进ATP含量(P<0.01);与miR-3196 mimics联合,VPA可进一步促进细胞中ROS含量、细胞糖摄取及乳酸含量(P<0.01)、抑制细胞中ATP含量(P<0.01)。5、与Control组相比,VPA组及miR-3196 mimics组Hut 78及A3细胞中p-PI3K和p-AKT的表达降低(P<0.01)。miR-3196 inhibitor可显著促进Hut 78及A3细胞中p-PI3K和p-AKT的表达(P<0.01);与miR-3196 mimics联合,VPA可进一步抑制Hut 78、A3细胞中p-PI3K和p-AKT的表达(P<0.01)。结论:1.VPA可显著促进miR-3196在外周T细胞淋巴瘤细胞中的表达;2.VPA可通过miR-3196促进外周T细胞淋巴瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖,影响线粒体功能。3.VPA可通过miR-3196抑制外周T细胞淋巴瘤细胞PI3K/Akt通路激活。第二部分VPA通过miR-3196调控靶基因KCNK3的表达抑制外周T细胞淋巴瘤细胞增殖效应研究目的:检测VPA通过miR-3196抑制PTCL细胞增殖与KCNK3表达的相关性。方法:1、GEO数据集(GSE132550)及miRTar Base、starbase2.0等在线软件分析miR-3196的潜在靶基因,并通过双荧光素酶报告基因载体验证其靶基因的关系。2、q RT-PCR及Western blot检测VPA对Hut 78及A3细胞中KCNK3表达的影响。3、利用脂质体,分别将miR-3196 inhibitor、si-KCNK3转染入Hut 78及A3细胞,VPA干预24h后,Ed U检测细胞增殖能力变化;Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡变化;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白(Bad、Bcl-2、Cleaved Caspase-3)及PI3K/Akt通路蛋白表达。结果:1、通过GEO数据集(GSE132550)及miRTar Base、starbase2.0等在线软件分析发现,包括KCNK3在内的均为miR-3196的潜在靶基因,同时,KCNK3在GSE132550的数据集中log FC=7.19及P<0.05。q RT-PCR及Western blot检测分析发现,VPA干预后,可显著抑制Hut 78及A3细胞中KCNK3的表达(P<0.01);miR-3196 inhibitor后,可显著促进Hut 78及A3细胞中KCNK3的表达(P<0.01);而VPA干预后,可显著抑制Hut 78及A3细胞中KCNK3的表达(P<0.01)。荧光素酶检测分析发现,miR-3196与KCNK3存在靶基因的关系。2、Ed U检测分析发现,VPA干预后,可显著抑制Hut 78及A3细胞增殖能力(P<0.01),抑制miR-3196的表达可显著促进Hut 78及A3细胞增殖(P<0.01);与inhibitor组比较,VPA+inhibitor组细胞增殖显著降低(P<0.01);与inhibitor组比较,si-KCNK3+inhibitor显著抑制细胞增殖(P<0.01);与si-KCNK3+inhibitor组比较,VPA联合组细胞增殖显著降低(P<0.01)。3、Annexin V-FITC/PI双染检测分析发现,VPA干预后,可显著促进Hut78及A3细胞凋亡(P<0.01),抑制miR-3196的表达可显著抑制细胞凋亡(P<0.01);与inhibitor组比较,VPA+inhibitor组细胞凋亡水平显著增加(P<0.01);与inhibitor组比较,si-KCNK3+inhibitor可显著促进细胞凋亡(P<0.01);与si-KCNK3+inhVP-16生产商ibitor组比较,VPA联合组细胞中细胞在凋亡显著增加(P<0.01)。4、VPA可显著促进Hut 78及A3细胞中Bad及Cleaved caspase-3蛋白的表达(P<0.01),抑制Bcl-2蛋白的表达(P<0.01),而miR-3196 inhibitor可显著抑制Bad及Cleaved caspase-3蛋白的表达(P<0.01),促进Bcl-2蛋白的表达(P<0.01);与inhibitor组比较,VPA+inhibitor可显著促进Bad及Cleaved caspase-3蛋白的表达(P<0.01),抑制Bcl-2蛋白的表达(P<0.01);与inhibitor组比较,与si-KCNK3+inhibitor组比较,VPA联合组细胞中Bad及Cleaved caspase-3蛋白的表达显著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白的表达显著降低(P<0.01)。5、VPA可显著抑制Hut 78及A3细胞中p-PI3K、p-Akt蛋白的表达(P<0.01),而miR-3196 inhibitor可显著促进p-PI3K、p-Akt蛋白的表达(P<0.01);与inhibitor组比较,VPA+inhibitor可显著抑制p-PI3K、p-Akt蛋白的表达(P<0.01);与inhibitor组比较,si-KCNK3+inhibitor可显著抑制pPI3K、p-Akt蛋白的表达(P<0.01);与si-KCNK3+inhibitor组比较MRI-directed biopsy,VPA联合组显著抑制p-PI3K、p-Akt蛋白的表达(P<0.01)结论:1.在PTCL中,KCNK3是miR-3196的靶基因。2.VPA可通过miR-3196抑制KCNK3的表达,促进外周T细胞淋巴瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖。3.VPA可通过miR-3196抑制KCNK3的表达后,抑制外周T细胞淋巴瘤细胞PI3K/Akt通路激活。